蚯蚓提取物地龍2號對實驗性大鼠肝纖維化的影響

蚯蚓提取物地龍2號對實驗性大鼠肝纖維化的影響

肝纖維是指肝臟中的纖維生成超過分解的，以及特定細胞（ecm）在肝臟中積聚過度積聚引起的肝臟纖維生成。大量研究表明膠原酶、纖溶酶等參與了ECM的降解。地龍2號是采用生物工程技術從中藥地龍中提取的有效活性成分,主要含有蚯蚓纖溶酶及蚯蚓膠原酶。既往研究發(fā)現(xiàn)地龍2號可以抑制CCl4誘導的大鼠肝內纖維組織的形成,減輕肝細胞的損害,降低血中透明質酸及層粘連蛋白的含量,具有抗肝纖維化作用。本研究旨在探討地龍2號對大鼠肝纖維化形成過程中肝組織內α肌動蛋白(α-SMA)、轉化生長因子β1(TGFβ1)、尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)及Ⅰ型纖溶酶原激活抑制物(PAI-1)蛋白表達的影響,以探討其抗大鼠肝纖維化的機理。材料和方法一、材料表面動物為雄性Wistar大鼠,體重(160±10)g,購自河南醫(yī)科大學實驗動物中心。二、方法1.模型的制作52只大鼠隨機分成6組:正常組(N,6只);模型組(M,10只):40%CCl4與花生油混合液0.02ml/kg背部皮下注射(首劑為75%CCl4花生油混合液0.05ml/kg),每周2次,單蒸水灌胃10ml·kg-1·d-1;陰性對照組(NC,6只),花生油皮下注射,單蒸水灌胃,量及用法同模型組;陽性對照組(PC,10只):秋水仙堿0.1mg·kg-1·d-1灌胃,單蒸水配制;地龍2號大劑量組(Eh,10只):地龍2號50mg·kg-1·d-1灌胃,單蒸水配制;地龍2號小劑量組(El,10只),地龍2號25mg·kg-1·d-1灌胃,單蒸水配制,PC、Eh及El組CCl4造模方法同M組。所有藥物均現(xiàn)配現(xiàn)用,每只大鼠用藥前均稱體重。存活大鼠均于第8周末處死,分別切除同一解剖部位的肝臟于10%中性緩沖福爾馬林液中固定,石蠟包埋。2.upa及pai-1多克隆抗體按SP試劑盒(福州邁新公司)操作說明,兔抗大鼠α-SMA、TGFβ1、uPA及PAI-1多克隆抗體(武漢博士德公司),工作濃度分別為1∶150、1∶100、1∶50及1∶50。每次染色均采用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照,在光鏡下觀察,陽性反應呈棕黃色。3.顯色指數(shù)的計算參照免疫組化顯色標準略修改:每張切片均由二位病理科主任醫(yī)師分別觀察5個顯色較好的高倍鏡視野,分別記錄顯色程度和顯色范圍。顯色程度分弱、中、強,用(+)、(++)、(+++)記錄;顯色范圍占高倍視野<1/4時記錄為(+)、～2/4為(++)、～3/4為(+++)、>3/4為(++++)。然后按以下公式計算。顯色指數(shù)=顯色程度×顯色范圍(+、++、+++、++++分別按1、2、3、4分計算)。二位醫(yī)師的檢查結果取均數(shù)為每一種蛋白表達的最終顯色指數(shù)。三、統(tǒng)計分析方法計量資料以均數(shù)±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,用SPS10.0軟件包統(tǒng)計分析,兩組間差異用單因素方差分析,相關性研究采用Spearman等級相關分析,P<0.05為差異有顯著意義。mt組不同部位顯色指數(shù)tgf1和pai-1的表達N及NC組血管壁可見少量α-SMA陽性表達;M組α-SMA陽性表達細胞數(shù)明顯增多,主要分布于門靜脈、匯管區(qū)、纖維間隔和鄰近的肝竇;Eh及El組較M組顯色指數(shù)顯著降低,(P<0.01)(表1,見封三圖1、2)。N及NC組TGFβ1表達極低;M組TGFβ1在匯管區(qū)和纖維隔中染色明顯加深;Eh及El組于上述部位顯色指數(shù)明顯減輕(P<0.01)(表1,見封三圖3、4)。N及NC組uPA表達極低;M組uPA在匯管區(qū)和纖維隔中染色明顯加深,主要見于肝臟星狀細胞胞漿中,呈強陽性表達;與M組相比,Eh及El組顯色指數(shù)減輕(P<0.05)(表1,見封三圖5、6)。N及NC組PAI-1表達很低;M組于匯管區(qū)、纖維間隔、血管和膽管細胞及肝竇可見大量PAI-1陽性染色,且與上述部位毗鄰的肝細胞漿內亦可見棕黃色染色;與M組相比,Eh及El組顯色指數(shù)降低(P<0.05)(表1,見封三圖7、8)。不同藥物干預對肝纖維化大鼠肝臟中-sma和tgf1的表達肝星狀細胞(HSC)在肝纖維化時可發(fā)生表現(xiàn)型改變,稱為“活化”。受HSC調控的ECM的產(chǎn)生與降解失平衡,是各種病因肝纖維化發(fā)生的共同中心環(huán)節(jié)。激活的HSC可分泌多種細胞因子,其中TGFβ1是最關鍵的致纖維化因子。激活的HSC不僅能夠自身分泌TGFβ1,且后者與受體的結合能力也明顯增加,這種自分泌正反饋調節(jié)是肝纖維化得以發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。本實驗中,未發(fā)生肝纖維化的N組及NC組中α-SMA與TGFβ1表達很少甚至不表達;已發(fā)生肝纖維化的模型組中α-SMA與TGFβ1表達都明顯升高,多見于匯管區(qū)和纖維隔中,肝血竇中也明顯可見;而應用地龍2號后α-SMA與TGFβ1的表達有顯著減輕。由于α-SMA是HSC激活的標志,且TGFβ1由活化的HSC產(chǎn)生,TGFβ1的表達升高與肝纖維化的程度有正相關關系,所以我們推測地龍2號可能通過抑制HSC的活化、降低TGFβ1的表達而減輕肝纖維化。近年來研究表明,u-PA對HSC有直接促有絲分裂的作用,抑制u-PA的表達可以降低HSC的活性,從而延緩纖維化的發(fā)生發(fā)展。HSC激活后使PAI-1增加,抑制纖溶酶原的激活,PAI-1也能降低基質金屬蛋白酶的活力,結果使ECM的降解減少。本實驗研究表明,用CCl4造模8周后,已發(fā)生肝纖維化的模型組中uPA及PAI-1在匯管區(qū)和纖維間隔中染色明顯加深,膽管細胞及肝竇亦可見大量PAI-1表達,而且與α-SMA及TGFβ1表達部位相同,與α-SMA及TGFβ1的表達升高也有明顯的正相關關系;用地龍2號藥物干預后,肝纖維化大鼠肝臟的uPA及PAI-1表達