微生物限度方法學(xué)驗證

微生物程度檢查辦法學(xué)驗證一、檢查辦法根據(jù)微生物計數(shù)法（中國藥典四部1105）；控制菌檢查法（中國藥典四部1106）；非無菌藥品微生物程度原則（中國藥典四部1107）；抑菌效力檢查法（中國藥典四部1121）檢查。二、菌種、培養(yǎng)基及稀釋液表1菌種菌種名稱菌種代數(shù)菌種狀態(tài)廠家大腸埃希菌[CMCC(B)44102]3正常浙江省食品藥品檢查研究院金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]3正常枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]3正常白色念珠菌[CMCC(F)98001]3正常黑曲霉[CMCC(F)98003]3正常乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50094]3正常表2培養(yǎng)基培養(yǎng)基名稱批號廠家營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基150222北京三藥科技開發(fā)公司改良馬丁培養(yǎng)基150134北京三藥科技開發(fā)公司改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基150215北京三藥科技開發(fā)公司營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基150317北京三藥科技開發(fā)公司玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基150323北京三藥科技開發(fā)公司膽鹽乳糖培養(yǎng)基150127北京三藥科技開發(fā)公司膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基150214北京三藥科技開發(fā)公司四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基150416北京三藥科技開發(fā)公司MUG培養(yǎng)基150122北京三藥科技開發(fā)公司曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基150137北京三藥科技開發(fā)公司三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基150207北京三藥科技開發(fā)公司表3對照用培養(yǎng)基對照培養(yǎng)基名稱批號廠家營養(yǎng)肉湯對照培養(yǎng)基13中國食品藥品檢定研究院營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基13中國食品藥品檢定研究院玫瑰紅鈉瓊脂對照培養(yǎng)基13中國食品藥品檢定研究院膽鹽乳糖對照培養(yǎng)基13中國食品藥品檢定研究院膽鹽硫乳瓊脂對照培養(yǎng)基13中國食品藥品檢定研究院四硫磺酸鈉亮綠對照培養(yǎng)基13中國食品藥品檢定研究院MUG對照培養(yǎng)基13中國食品藥品檢定研究院曙紅亞甲藍瓊脂對照培養(yǎng)基13中國食品藥品檢定研究院三糖鐵瓊脂對照培養(yǎng)基表4試劑試劑名稱批號級別磷酸二氫鉀130826分析純氫氧化鈉0117分析純氯化鈉0714分析純聚山梨酯801011化學(xué)純95%乙醇15070722藥用級二甲氨基苯甲醛0402分析純鹽酸0533分析純稀釋液：（1）pH6.8緩沖液取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液250ml,加0.2mol/L氫氧化鈉溶液118ml,用水稀釋至1000ml，搖勻，既得。（2）0.9%無菌氯化鈉溶液取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，過濾，分裝、滅菌。（3）0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液取聚山梨酯800.5ml，用0.9％無菌氯化鈉溶液溶解并稀釋至1000ml，濾過，分裝，滅菌，備用。（4）靛基質(zhì)試液取對二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充足振搖，使完全溶解后，取鹽酸20ml漸漸滴入。三、菌液的制備1細菌、霉菌、酵母菌接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48小時。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7天，加入5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，然后吸出孢子懸液（用帶有無菌棉花的能過濾菌絲的無菌毛細吸管）用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用，若保存在2～8℃可在24小時內(nèi)使用。2控制菌接種大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為10～100cfu的菌懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時內(nèi)使用，若保存在2～8℃可在24小時內(nèi)使用。四、驗證內(nèi)容1、計數(shù)辦法驗證將制備好的菌懸液用0.9%無菌氯化鈉溶液以每10倍體積分別稀釋成一系列濃度菌懸液，運用血球計數(shù)板計數(shù)，擬定具體菌懸液濃度，取靠近于10cfu-100cfu的稀釋濃度，選用各項實驗項下的規(guī)定濃度進行實驗。稀釋及觀察均應(yīng)在陽性室內(nèi)完畢。通過驗證當(dāng)原液稀釋至10-6時，菌液濃度靠近100cfu/ml。2、合用性檢查2.1細菌、霉菌、酵母菌取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各1ml(內(nèi)含菌約50～100cfu)，分別注入無菌平皿中，立刻傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株實驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置30～35℃培養(yǎng)48小時，計數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉1ml(內(nèi)含菌約50～100cfu)，注入無菌平皿中（取用黑曲霉時應(yīng)注意本身安全），立刻傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株實驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置23～28℃培養(yǎng)72小時，計數(shù)。同時，用對應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述實驗，作為對照。其大小、形態(tài)應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致，且數(shù)量應(yīng)不不大于對照培養(yǎng)基的70%。細菌、霉菌及酵母菌培養(yǎng)基合用性檢查培養(yǎng)基名稱菌種名稱測試培養(yǎng)基（cfu）對照培養(yǎng)基（cfu）回收率(%)大小形態(tài)原則結(jié)論碟1碟2平均碟1碟2平均營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌87838595999787.6一致大小形態(tài)一致且回收率≥70%符合規(guī)定金黃色葡萄球菌88828594989688.5一致大小形態(tài)一致且回收率≥70%符合規(guī)定大腸埃希菌838684.595959588.9一致大小形態(tài)一致且回收率≥70%符合規(guī)定玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌848785.5999496.588.6一致大小形態(tài)一致且回收率≥70%符合規(guī)定金黃色葡萄球菌908688971019988.9一致大小形態(tài)一致且回收率≥70%符合規(guī)定大腸埃希菌888385.5929995.589.5一致大小形態(tài)一致且回收率≥70%符合規(guī)定培養(yǎng)基中細菌、霉菌、酵母菌的生長狀況良好，回收率在80%，且與對照培養(yǎng)基狀態(tài)一致，證明此批次培養(yǎng)基能夠精確的檢測出對應(yīng)微生物狀況。2.2控制菌2.2.1內(nèi)含菌約營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)含菌約內(nèi)含菌約同時，用對應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述實驗，作為對照，2.2.22.2.3控制菌培養(yǎng)基合用性檢查培養(yǎng)基名稱促生長性（與對照比較）克制性（與對照比較）金黃色平葡萄球菌批示性（與對照比較）結(jié)論菌種名稱形態(tài)大小形態(tài)大小批示反映無生長------符合規(guī)定--符合規(guī)定營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基--------符合規(guī)定--------符合規(guī)定無生長------符合規(guī)定--符合規(guī)定--符合規(guī)定--符合規(guī)定培養(yǎng)基的促生長性及批示性菌落生長狀態(tài)一致，克制性均無菌落生長，闡明培養(yǎng)基合用性良好。3、抑菌性：取持續(xù)生產(chǎn)的三批樣品進行測定3.1細菌、霉菌、酵母菌3.1.1供試液的制備：稱取本品10g，加pH6.8緩沖液100ml，混勻，制成1：3.1.2實驗組：取大腸埃希菌菌懸液、金黃色葡萄球菌菌懸液和枯草芽孢桿菌菌懸液各1ml，分別加上述供試液1ml，注入平皿中，立刻傾注15～20ml溫度不超出45℃溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，每株實驗菌平行制備2個平皿，31.3菌液組：取上述各實驗菌液1ml，加入對應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每株實驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。3.1.4供試品對照組：取供試液1ml，分別注入15～20ml溫度不超出45℃溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基3.1.5以供試品對照組為樣品空白(C0)、以菌液組為對照(T)、以實驗組為測試品(C)計：(C-C0)/T≥70%細菌、霉菌及酵母菌抑菌性檢測成果統(tǒng)計批號培養(yǎng)基名稱菌種培養(yǎng)時間（h）菌液組菌數(shù)Cfu實驗組菌數(shù)Cfu供試品對照組菌數(shù)回收率%數(shù)值平均數(shù)值平均數(shù)值平均150804營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌7284869092.581095.9728895金黃色葡萄球菌7286849391.597.072829012大腸埃希菌728485.5919295.9728793玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌1208686.584850098.31208786金黃色葡萄球菌1208787.5858698.312088870大腸埃希菌1208785.5838397.11208483150805營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌7288859592.56597.1728690金黃色葡萄球菌728584.59593.595.57284924大腸埃希菌728184.58991.597.7728794玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌12083858787.50097.11208788金黃色葡萄球菌12086848886.597.112082850大腸埃希菌1208884868895.51208090150806營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌728785.59495.56695.5728497金黃色葡萄球菌728386969695.67289966大腸埃希菌728585.5959695.0728697玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌120848485870096.61208489金黃色葡萄球菌1208585.5908996.112086880大腸埃希菌1208283.5898796.01208585通過持續(xù)三批次不同種菌類的加樣，回收率均在90%以上，闡明本產(chǎn)品對于細菌、霉菌及酵母菌不含有抑菌性。3.2控制菌3.2.1取10供試液（制備辦法同3.1.1）及1ml(10～100cfu)加入3.2.2取10供試液（制備辦法同3.1.1）1ml(10～100cfu)3.3合格原則若上述實驗檢測出實驗菌，則按此供試液制備辦法和控制菌檢查辦法進行供試品的該控制菌檢查?？刂凭志詸z查大腸埃希菌實驗組（+/-）陰性對照組（+/-）MUG++--靛基質(zhì)++--沙門氏菌實驗組（+/-）陰性對照組（+/-）四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基++--膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基+