神經(jīng)肌肉病病理診斷的發(fā)展歷程

神經(jīng)肌肉病病理診斷的發(fā)展歷程

病理診斷是確定疾病診斷的“金標準”。隨著科學技術(shù)的發(fā)展,盡管現(xiàn)代影像學檢查等多種無創(chuàng)檢查技術(shù)可以為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷提供可靠的病變部位,但常常仍難以明確病變性質(zhì)。為明確診斷,應鼓勵有針對性的開展活體組織的病理檢查。1肌肉病的診斷自1865年Criesinger首先實施開放性肌肉活檢,1868年Duchenn制作肌肉活檢針研究肌肉疾病,到1953年DennykBrown和Pearson撰寫的第一部肌肉疾病專著問世,80多年間神經(jīng)肌肉病的臨床病理診斷發(fā)展很慢,直到20世紀60年代,恒冷冰凍切片技術(shù)、酶組織化學技術(shù)和電鏡的應用,才使神經(jīng)肌肉病的病理診斷有了長足的發(fā)展。20世紀80年代,我國北京、上海、南京、濟南、長沙、福州、長春等地相繼開展了神經(jīng)肌肉病的臨床病理診斷工作;1991年中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會肌肉學組成立;2000年以來采用免疫組織化學技術(shù),應用不同的抗體對病變肌肉組織作出準確的定位,進一步提高了肌肉活檢的診斷水平。肌肉活檢多由神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生親自操作,因為熟悉病變累及的部位,能選取適合診斷的肌肉。目前國外推崇針刺活檢,認為取材創(chuàng)傷小,可以多次、多部位取材,但針刺活檢取材量小,難以反映疾病的全貌,而且,為選取滿意的檢查樣品多次取材,損傷也不小,而且不是直視下取材,有傷及周圍神經(jīng)和血管的風險,所以目前國內(nèi)各家仍采用開放性肌肉活檢。早年肌肉活檢病理診斷發(fā)展緩慢,是由于僅用石蠟切片,在制片過程中許多組織成分丟失,偽差較多。冰凍切片酶組化染色使大部分組織結(jié)構(gòu)保留,提高了活檢的診斷水平,發(fā)現(xiàn)了許多新病種,在此基礎(chǔ)上,分子基因及其編碼蛋白的檢測使許多遺傳性神經(jīng)肌肉病的基因得以確立,神經(jīng)生化檢查為代謝性肌肉疾病進一步分出了亞類,結(jié)合神經(jīng)電生理、超聲及影像學的檢查,使人們對神經(jīng)肌肉疾病從簡單的臨床病理研究發(fā)展到了基因和蛋白分子水平的診斷。2肌肉激活法2.1超聲檢查的應用肌肉活檢選位的原則是,嚴重肌肉萎縮的患者,選病變相對輕的部位,因為神經(jīng)肌肉病晚期肌纖維被脂肪結(jié)締組織取代,難以作出診斷;病情比較輕的患者選癥狀最重的部位。同時注意避開表皮血管和皮膚損傷處。常用的肌肉活檢部位為:肱二頭肌、脛骨前肌、腓腸肌、股四頭肌,少數(shù)采用肱三頭肌、三角肌、崗上肌。也有骨科手術(shù)臨近部位如脊柱畸形矯正術(shù)取棘旁肌、胸外科手術(shù)取的肋間肌等。一般來講,以近端無力為主的肌肉疾病選取肢體近端肌肉活檢,如多發(fā)性肌炎、進行性肌營養(yǎng)不良,而遠端受累為主的神經(jīng)肌肉病常選脛骨前肌,因為手足多為神經(jīng)肌腱集中的地方,容易造成功能損害,所以很少有人選取手足肌肉做病理檢查。常用于肌肉注射的部位不宜做肌肉活檢,如臀肌和三角肌,另外,術(shù)前肌電圖針刺部位也不宜活檢,所以如果想用肌電圖確定對稱性肌肉病的活檢部位時,常用右側(cè)肌電圖檢查,把左側(cè)可能用的肌肉留出來。此外,應避免在靠近肌腱處進行活檢,因此處肌纖維常與結(jié)締組織混雜交織存在,且內(nèi)核肌纖維多,電鏡下見Z線扭曲等變化,易誤診為強直性肌病。超聲檢查是一種簡單、快捷的評估肌肉病變程度的技術(shù),可以協(xié)助活檢部位的選擇。肌肉磁共振對不同疾病具有更高的圖像清晰度,能更好地反映病變改變規(guī)律,但是價格不菲,超聲檢查是更快速和實用的方法。2.2肌肉注射和針刺活檢常規(guī)消毒,鋪洞巾。局部麻醉:2%利多卡因5ml,加1滴腎上腺素,可以減少術(shù)野出血。注意麻醉藥不能注入肌肉。切口長度:2～3cm,脂肪層厚的患者切口適當加長,鈍性分離皮下組織至深筋膜,切開,分離并充分暴露肌肉組織,確定沒有大血管、神經(jīng)進入肌束,用彎止血鉗輕柔挑取肌束,取直徑0.5cm,長1cm的肌肉(避免肌肉過度牽拉),紗布壓迫止血,分層縫合深筋膜和皮膚,無菌紗布及彈力繃帶加壓包扎(可以防止術(shù)野滲血,但要在3h后放松,避免包扎部位遠端腫脹)。針刺活檢常用于小兒或診療過程中的重復活檢,僅限于肌肉量多、危險性低的股四頭肌。國內(nèi)同行很少采用,故不在此贅述。2.3樣品處理方法2.3.1冷凍肌肉組織標本將所取肌肉標本用耦合劑垂直固定在準備好的硬紙板上。在液氮中預冷異戊烷,不斷攪拌至其出現(xiàn)白色結(jié)晶表示冷凍完全。然后用大鑷子把固定在硬紙板上的肌肉組織標本快速放入冷卻的異戊烷中,并小心左右晃動組織塊,冰凍約2min,使組織塊迅速充分凍結(jié)后放入液氮中(標本可在液氮庫或-80℃或-160℃冷凍條件下可長期保存)。-20℃～-25℃恒冷冰凍切片連續(xù)切片,厚度為8～10μm。2.3.2電鉻樣品處理取1mm×1mm×1mm肌肉樣品,可以多留取幾塊,置事先預冷的2.5%戊二醛內(nèi)4℃保存,樹脂包埋前鋨酸后固定。2.3.3生物化學研究因代謝異常導致的肌病最終需要生化數(shù)據(jù),取材同時需留取100～200mg密封保存在-80℃冰柜中。2.3.4永久性樣品用于保存剖檢得到的標本,臨床病理診斷目前多采用冰凍切片,如有特殊需要,可將剩余的冰凍組織石蠟包埋保存。2.4一般染色方法2.4.1pahs和pas染色蘇木精-伊紅染色(HE)、改良Gomori三色染色(MGT)、輔酶Ⅰ-四氮唑還原酶染色(NADH-TR)、腺苷三磷酸酶染色(ATPase)、細胞色素C氧化酶染色(COX)、琥珀酸脫氫酶染色(SDH)、細胞色素酶和琥珀酸脫氫酶雙重染色(SDH/COX)、非特異酯酶染色(NSE)、糖原PAS染色(PAS)、堿性磷酸酶染色(AKP)、酸性磷酸酶染色(ACP)、油紅O染色(ORO)等。2.4.2表面織構(gòu)相關(guān)抗體與肌膜蛋白缺陷相關(guān)的抗體有:抗肌萎縮蛋白(dystrophin)、肌聚糖蛋白(sarcoglycans)、dysferlin、caveolin-3、層粘連蛋白α2(lamininα2)、膠原蛋白Ⅵ(collagenⅥ)等。與核蛋白缺陷相關(guān)的抗體有:伊默菌素(emerin)、核纖層蛋白A/C(laminA/C)等。與肌原纖維和細胞骨架蛋白缺陷相關(guān)的抗體有:肌球蛋白重鏈(myosinheavychain,MYHC)、myotilin、telethonin、肌聯(lián)蛋白(ttin)、伴肌動蛋白(nebulin)、結(jié)蛋白(desmin)、網(wǎng)蛋白(plectin)等。3肌肉激活的適應性和禁忌3.1肌肉活檢的檢查(1)凡是主訴肢體無力、肌肉萎縮或肢體肌肉疼痛者,在相關(guān)輔助檢查后仍不能確定病變性質(zhì)者;(2)其他系統(tǒng)的疾病,如血管炎、結(jié)節(jié)病或結(jié)締組織病累及肌肉者;(3)檢查發(fā)現(xiàn)肌酶升高,或肌電圖檢查顯示為肌源性損害者,經(jīng)征得患者及家屬同意即可肌肉活檢。必須肌肉活檢的疾病:先天性肌肉病、炎性肌肉病、代謝性肌肉病(線粒體肌病、糖元累積病和脂質(zhì)沉積病)。選擇性肌肉活檢的疾病:進行性肌營養(yǎng)不良、神經(jīng)源性肌萎縮。除肌肉疾病之外,伴有肌肉損害的其它疾病,如結(jié)節(jié)性動脈周圍炎、肌陣攣性癲癇、Lafora病、蠟樣脂-脂褐素增多癥等,亦需要做肌肉活檢。一般不做肌肉活檢但需要與其他疾病鑒別時做:神經(jīng)肌肉接頭病(重癥肌無力)、離子通道病(周期性癱瘓)等。3.2肌肉激活的禁忌有出血傾向或手術(shù)部位有炎癥者不宜手術(shù)。糖尿病患者要慎重決定。4肌肉激活可以解決這些問題石蠟切片不能做酶組化檢查,只能診斷炎癥性肌肉病和結(jié)締組織病,可以用于剖檢病例組織不夠新鮮時,一般已不用于臨床診斷。4.1肌纖維類型的檢測有10余種染色方法,其中最基礎(chǔ)的是HE染色,可以評價肌肉萎縮的程度,如萎縮肌纖維多呈圓形,呈鑲嵌狀分布者多為肌源性肌病;而出現(xiàn)小角化纖維,呈簇狀分布的多為神經(jīng)源性肌病。肌束周圍肌萎縮是多發(fā)性肌炎特別是皮肌炎的特點。HE染色可以觀察肌膜核的改變。肌膜核增加可見于強直性肌營養(yǎng)不良;固縮核聚集(pyknoticnuclearclump)多見于神經(jīng)源性肌病。觀察壞死及再生纖維的分布和數(shù)量。觀察肌纖維內(nèi)空泡的分布,如果所有的肌纖維都有空泡,常為組織凍結(jié)過程中的偽像;大量比較均勻的空泡出現(xiàn)在Ⅰ型纖維時,高度懷疑脂代謝異常肌病;見到大小不同的明亮空泡時,糖原病的可能性大,有些空泡內(nèi)含有嗜堿性物質(zhì),是糖原貯積癥Ⅱ型(Pompe病)的診斷依據(jù);還可以見到慢性進展的肌營養(yǎng)不良時出現(xiàn)的肌纖維分裂(fibersplitting);輪狀纖維(ringfiber);強直性肌營養(yǎng)不良見到的肌漿塊(sarcoplasmicmass)。觀察肌間質(zhì)血管周圍有無炎細胞浸潤,肌梭、肌膜及神經(jīng)終末的改變。MGT易于發(fā)現(xiàn)桿狀體肌病胞體內(nèi)的異常桿狀體,而在HE染色中是不能發(fā)現(xiàn)的。還能見到遠端型肌病中的特征性改變鑲邊空泡(rimmedvacuole)。也可以看到破碎紅纖維(raggedredfiber)-診斷線粒體肌病的重要線索,需進一步電鏡證實有無線粒體內(nèi)異常包涵體。NADH-TR可以確定肌纖維類型觀察到肌原纖維網(wǎng)的異常。靶和靶樣纖維多見于神經(jīng)源性肌萎縮;中央軸空病可見到多數(shù)肌纖維中心部位空芯;肌源性肌病可見肌纖維內(nèi)不規(guī)則形狀的低活性部分,稱蟲噬樣改變。HE、MGT和NADH-TR3種染色是診斷神經(jīng)肌肉病的最基本方法,3種染色1h內(nèi)可以完成,在此基礎(chǔ)上,再加用其他相關(guān)染色,更有針對性。SDH、COX染色可以作為NADH-TR的補充,進一步發(fā)現(xiàn)線粒體的異常。ACP染色顯示高活性的是壞死纖維中的巨噬細胞、自噬反應細胞(糖原?、蛐秃丸傔吙张?、再生纖維、蠟樣脂褐素沉積癥的蓄積物。是診斷炎癥性肌病、糖原病和蠟樣脂褐素沉積癥非常有用的方法。PAS染色是細胞內(nèi)糖原貯積的糖原病和多糖體貯積性疾病的診斷必需的。ORO染色對細胞內(nèi)脂肪貯積的脂肪代謝異常性肌病(lipidstoragemyopathy)的診斷有特征性。ATPase染色是區(qū)分肌纖維類型的最佳方法。可以發(fā)現(xiàn)肌纖維類型的分布異常。除了診斷明確的神經(jīng)源性肌病之外,其他基本只要1型纖維超過55%,就可稱為1型纖維優(yōu)勢。這種病理改變最常見于先天性肌病(中央軸空病、桿狀體肌病、肌管性肌病、先天性肌纖維類型不均衡)。ATPase染色還可以判定萎縮肌纖維的類型,不同pH值染色可以清楚區(qū)分1、2型肌纖維,2型纖維中還可以分為2A、2B和2C纖維。2B纖維缺乏多見于進行性肌營養(yǎng)不良、先天性肌病和代謝性肌病。2C纖維大量出現(xiàn)具有臨床意義,見于以下3種情況:a.未成熟肌纖維的殘存;b.再生肌纖維;c.在神經(jīng)源性疾病中神經(jīng)再支配旺盛的肌肉,在肌纖維群組化的同時可以見到大量的2C纖維。染色方法較為麻煩,常用于肌病的研究。AKP染色可以判定再生初期的纖維。NSE染色用于顯示神經(jīng)肌肉接頭處,確定運動終板的存在,失神經(jīng)的小角化纖維濃染。AChE染色可以特異性染出神經(jīng)肌肉接頭,但臨床很少用。肌肉活檢常規(guī)組織化學和酶組織化學染色可對神經(jīng)肌肉病作出初步的分類,如神經(jīng)源性損害、肌源性損害、肌營養(yǎng)不良、炎癥性肌病、線粒體肌病、脂質(zhì)沉積病、糖原累積病、先天性肌病等。4.2肌營養(yǎng)不良類型在常規(guī)組織化學和酶組織化學染色基礎(chǔ)上,肌肉的分子病理診斷是通過免疫組織化學方法對肌病做進一步的分類診斷,如進行性肌營養(yǎng)不良的各種亞型。Dystrophin可以診斷DMD和BMD;Sarcoglycans和Dysferlin可用來診斷肢帶型肌營養(yǎng)不良;Emerin可用于診斷Emery-Drifuss型肌營養(yǎng)不良等。分子病理學研究的成就在不斷改變我們對肌病的診斷路徑。常規(guī)的組織學和酶組織化學染色已經(jīng)不能滿足診斷的需要,必須采取針對不同蛋白的免疫組織化學檢查。4.3臨床基因檢查中的基因功能檢查已為廣大民眾所關(guān)注,對某些已知基因突變的肌病進行篩查,可為遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供參考。在部分肌營養(yǎng)不良、周期性癱瘓、線粒體病、神經(jīng)肌肉接頭病和先天性肌病診斷中發(fā)揮更重要的作用。但由于基因突變的多樣性和檢測手段及費用的限制,臨床基因檢查在目前只能解決具有熱點突變的遺傳性肌病的診斷,許多遺傳性肌病還需要確定其熱點突變。多數(shù)情況下發(fā)現(xiàn)致病突變可以診斷疾病,而陰性的結(jié)果不能排除診斷。在此基礎(chǔ)上,尚需要進一步分析相關(guān)基因所編碼蛋白具有哪些功能以及在基因突變后的功能改變。同時,需要研究不同基因突變后采取哪些治療更有幫助。4.4現(xiàn)代化技術(shù)在肌肉病理改變中的應用電鏡檢查對線粒體肌病、糖原