羊傳染性膿皰皮炎病毒的研究進(jìn)展

羊傳染性膿皰皮炎病毒的研究進(jìn)展

綿羊感染性膿皮炎通常被稱為“羊口傷口”。它是由羊感染性膿皮炎（或fv）引起的綿羊、山羊和人類的急性、接觸性和嗜皮性傳染病引起的。它以羊、山羊和其他動(dòng)物的嘴唇、鼻孔周圍的皮膚、口腔粘膜和乳房為特征。它主要是由于皮膚和粘膜的增生性疾病（德爾菲等人，2003；張家新等人，2006）。本病常呈群發(fā)性流行,以3~6月齡的羔羊最易感,成年羊發(fā)病較少。雖然本病為溫和性疾病,但口、唇等部位病變嚴(yán)重時(shí),將嚴(yán)重影響羔羊吃奶、采食、吞咽,導(dǎo)致衰弱死亡,有報(bào)道患病羔羊的病死率可高達(dá)93%(Mazur等,1989)。目前,該病在歐洲、美洲、非洲等一些主要養(yǎng)羊國家廣為分布,嚴(yán)重威脅世界養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展和人類的健康。1orfv基因組ORFV基因組龐大,為線性雙股DNA,分子量約為88.8×106Dα。ORFV基因組長約130~150kb,然而不同毒株長度有10~25kb的差異。Robinson等(1982)用限制性酶切片段多態(tài)性分析(RFLP)方法對(duì)11株新西蘭分離株分析的結(jié)果表明,基因全長約為140kb;Gassmann等(1985)的研究結(jié)果表明,10株歐洲分離株基因全長約為138.2~141.2kb。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為ORFV包括130個(gè)基因,其中127個(gè)為線性基因,ORFV基因組包括位于兩末端的反向末端重復(fù)序列(ITR)和中間的一個(gè)大的編碼區(qū)(Cottone等,1998,Mercer等,1987),與痘病毒科其他成員相似。病毒基因組的兩端由ITR形成閉合環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu),并且ITR中存在0.5~1kb的變異片段。臨近發(fā)夾結(jié)構(gòu)處,有一段小于100bp的高度保守序列,其序列是決定DNA復(fù)制所必需的。中間區(qū)域基因相對(duì)保守(Robinson等,1987)。一般認(rèn)為ORFV基因組的兩端包括一些與病毒的毒力、宿主范圍、免疫逃避及免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的基因,具有病毒種屬特異性(Delhon等,2004)?；蚪M內(nèi)部結(jié)構(gòu)(即保守區(qū)DNA序列)包括一些與病毒在細(xì)胞中復(fù)制和病毒粒子在細(xì)胞漿中裝配成熟有關(guān)的基因。2dutpase的基因組織基因序列編碼ORFV是動(dòng)物病毒中體積最大、結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的病毒,其編碼產(chǎn)生的蛋白多達(dá)幾十種。ORFV編碼的功能蛋白主要有:dUTPase、42kD蛋白、IFNR、DNA聚合酶、RNA螺旋酶、病毒粒子蛋白、RAP94、后期基因轉(zhuǎn)錄蛋白、拓?fù)洚悩?gòu)酶、后期基因反式作用子、核心蛋白、RNA聚合酶、10kD蛋白、GM-CSF抑制因子(GIF)、IL-10和VEGF等。目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)是與其結(jié)構(gòu)組成、致病性、免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的一些蛋白。如10kD融合蛋白等對(duì)病毒結(jié)構(gòu)的形成具有重要作用。dUTPase、IFNR、IL-10、GM-CSF抑制劑(GIF)和VEGF等一些蛋白通過結(jié)合一些免疫調(diào)節(jié)因子并降低其活性,導(dǎo)致機(jī)體的免疫反應(yīng)降低,從而對(duì)宿主產(chǎn)生致病性。42kD蛋白、37kD蛋白等具有良好的免疫原性,能刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)。2.110kD蛋白Spehner等(2004)通過構(gòu)建缺失編碼10kD蛋白的基因的ORFV突變體對(duì)其超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),ORFV突變體仍能在其易感細(xì)胞上增殖并包裝成具有侵染性的病毒粒子,然而其表面缺乏ORFV特有的螺旋型微管結(jié)構(gòu),僅存在短且排列紊亂的微管。這表明ORFV編碼產(chǎn)生的10kD蛋白對(duì)其表面特征性微管結(jié)構(gòu)的形成起到非常重要的作用。2.2dUTPasedUTPase由ORFV中長約474bp的基因序列編碼產(chǎn)生,該蛋白以原核融合形式表達(dá)。Cottone等(2002)首次對(duì)ORFV編碼的dUTPase的功能活性進(jìn)行研究,體外試驗(yàn)結(jié)果表明,該酶的活性范圍較廣(pH6.0~9.0的條件下均能發(fā)揮活性),且能與dUTP特異性地結(jié)合,其中在pH7.0,Mg2+存在的情況下,該酶的活性最強(qiáng)。之后研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),缺失編碼dUTPase基因的甲型皰疹病毒突變體的致病力減弱,這暗示該蛋白酶對(duì)病毒毒力有決定作用;又有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),自然缺失編碼dUTPase的基因的ORFV突變體在細(xì)胞內(nèi)的增殖并未受到影響,但對(duì)細(xì)胞的致病性減弱,這進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。因此,編碼dUTPase的基因是一個(gè)毒力基因,對(duì)于缺失編碼dUTPase的基因或dUTPase活性低的病毒株,其對(duì)機(jī)體的致病性降低,很可能是由于該基因的缺失導(dǎo)致病毒復(fù)制過程中出現(xiàn)缺陷。2.3IFNRIFNR是由ORFV中長501bp的基因序列編碼產(chǎn)生,該蛋白又稱干擾素抗性蛋白,是一種雙鏈RNA結(jié)合蛋白,它能與IL-10一起產(chǎn)生,從而抑制干擾素的抗病毒效應(yīng)(Haig等,1998)。2.4IL-10ORFVIL-10是由ORFV基因組中長約558bp的基因序列編碼產(chǎn)生,其分子量大小約為22kD。限制性酶切片段多態(tài)性分析(RFLP)和Southern印跡的分析結(jié)果表明,不同毒株編碼IL-10的基因片段長度相同且位于ORFV基因組中的同一位置,僅個(gè)別核苷酸存在差異。編碼ORFVIL-10的基因序列的上游序列和下游序列高度保守,它們是痘病毒所特有的早期轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。不同毒株的類早期啟動(dòng)子序列相同,它是由位于啟動(dòng)子上游62nt處一個(gè)富含A+T的TAATAATGAACTATAA構(gòu)成,同時(shí)一個(gè)早期轉(zhuǎn)錄終止序列TTTTTAT被發(fā)現(xiàn)位于終止子下游101nt處(Moss,1994)。IL-10是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子,它具有抑制炎癥反應(yīng)、降低抗原遞呈作用和抑制T淋巴細(xì)胞活化等多種功能(Griitz,2005)。這些暗示ORFV編碼產(chǎn)生的IL-10能夠破壞感染動(dòng)物機(jī)體的先天性免疫反應(yīng)和特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)。2.5GM-CSF抑制因子(GIF)GIF是一種特異性的雙重細(xì)胞因子結(jié)合蛋白,由定位于ORFV基因組右末端的一段基因序列編碼產(chǎn)生(Deane等,2000),這段序列很可能是病毒宿主在相互適應(yīng)過程中由于基因發(fā)生重組而獲得。此外,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),僅副痘病毒屬成員具有編碼GIF的基因序列,因此依據(jù)該基因序列建立起的PCR診斷方法用于該屬成員的鑒定較為敏感和特異(Haig等,2002a)。ORFVGIF是ORFV編碼產(chǎn)生的細(xì)胞因子結(jié)合蛋白中第一個(gè)被報(bào)道的,它能夠與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)結(jié)合并且抑制二者的活性(Scet等,2003),這暗示著GM-CSF和IL-2在機(jī)體抗病毒感染過程中發(fā)揮著重要作用。GIF分子包含一個(gè)WDPWV基序,該基序能與Ⅰ型細(xì)胞因子受體超家族中的WSXWS基序結(jié)合,這對(duì)其生物學(xué)活性的發(fā)揮非常必要。此外,GIF蛋白的糖基化位點(diǎn)對(duì)其與GM-CSF的結(jié)合非常關(guān)鍵(McInnes等,2005)。2.6VEGFORFVVEGF是由與病毒基因組右末端的反向重復(fù)序列相鄰的一段基因序列編碼產(chǎn)生的一種多肽,這種多肽與哺乳動(dòng)物的血管內(nèi)皮生長因子(VEGFs)有一定的同源性(Ferrara等,1991)。然而,不同病毒株編碼的VEGF的氨基酸序列之間的差異較大。對(duì)不同毒株編碼產(chǎn)生的VEGF的功能分析結(jié)果表明,不同毒株編碼產(chǎn)生的VEGFs在生物學(xué)活性和與受體結(jié)合特異性上也存有差異,因此有人推測不同毒株編碼產(chǎn)生的VEGFs在ORFV感染過程中起到不同的作用。然而,最近一項(xiàng)研究結(jié)果表明,雖然編碼VEGF的基因序列及其在體外的生物學(xué)活性有顯著差異,但該病毒編碼產(chǎn)生的VEGF作為一種毒力因子,對(duì)自然宿主產(chǎn)生的致病性上功能相似,能引起相同的病理變化(包括血管化反應(yīng)、水腫、表皮角質(zhì)化和結(jié)痂等)。缺失編碼VEGF基因的重組病毒感染后引起的血管化程度明顯降低,并且在一定程度上減緩病毒的增殖。ORFV感染引起的以血管內(nèi)皮強(qiáng)烈增生和血管高度擴(kuò)張為特征的傳染性膿皰皮炎與其編碼產(chǎn)生的VEGF有關(guān),目前這一結(jié)論已得到證實(shí)(Wise等,2007)。2.742kD蛋白42kD蛋白是由位于ORFV基因組左末端的BamHⅠ/B片段上的B2L基因編碼產(chǎn)生,該蛋白與痘苗病毒的氨基酸同源性達(dá)42%。B2L基因長1137bp,是一重要的保護(hù)性抗原基因。B2L基因在病毒DNA開始復(fù)制后即活躍地開始翻譯。42kD蛋白是病毒囊膜的主要成分之一,可刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)(Sullivan等,1994)。雖然ORFV以細(xì)胞免疫為主,但該蛋白良好的免疫原性仍引起國內(nèi)外學(xué)者的高度重視,一些研究者用B2L基因與病毒囊膜亞單位中的其它保護(hù)性抗原基因進(jìn)行重組,以望獲得能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有效保護(hù)的基因工程苗。國內(nèi)王廷璞等(2006)通過將編碼42kD蛋白的B2L基因與pGEM-4Z載體進(jìn)行重組,已篩選出具有較高表達(dá)水平且能傳代的重組菌。2.839kD蛋白39kD蛋白是由ORFV基因組上的F1L基因編碼產(chǎn)生的,F1L基因長為1005bp,是一個(gè)完整的開放閱讀框。Czerny等(1997)用ORFV的單克隆抗體、競爭ELISA、免疫熒光和Westernblotting等多種方法對(duì)病毒囊膜上的多種蛋白進(jìn)行了研究,分析結(jié)果表明,ORFV的單克隆抗體都能與病毒表面特異性的抗原決定簇結(jié)合,39kD和22kD兩種蛋白是ORFV單克隆抗體的主要結(jié)合位點(diǎn)。其中39kD抗原多肽被認(rèn)為是病毒表面微管的組成成分之一,并且這種多肽很可能與誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體有關(guān)。3orfv感染后機(jī)體的免疫指標(biāo)檢測ORFV具有高度的嗜上皮性,目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為ORFV主要引起局部強(qiáng)烈的免疫反應(yīng),且以細(xì)胞免疫為主;體液免疫水平較為低下,且血液中產(chǎn)生的抗體消失很快,用常規(guī)的血凝、補(bǔ)反等試驗(yàn)方法均無法檢測(Torfason等,2002)。由于該病毒在免疫學(xué)上的特殊性,國內(nèi)外學(xué)者用ELISA、Westernblotting和瓊脂擴(kuò)散及多種免疫學(xué)方法對(duì)ORFV感染后機(jī)體的一些免疫學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測,然而報(bào)道結(jié)果不盡相同。Trueblood等和Jan等用常規(guī)的免疫試驗(yàn)方法沒有檢測到抗體的存在。Azwai等(1995)用ELISA和Westernblotting方法從被感染駱駝血清中檢測出特異性IgG和IgM的存在。Mckeever等認(rèn)為動(dòng)物在首次接種后只能產(chǎn)生少量抗體,但這些抗體具有記憶功能,當(dāng)再次接受抗原刺激時(shí),抗體滴度將會(huì)急劇上升,在接種后第5周達(dá)到高峰。Hussain等認(rèn)為ORFV中和抗體在機(jī)體感染后24d內(nèi)消失,中和抗體消失后即使給羊注射1×109PFU的病毒液也不發(fā)病。對(duì)感染ORFV12d的羊的淋巴液進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞明顯增多,因此,他認(rèn)為羊感染ORFV后介導(dǎo)的主要是細(xì)胞免疫。4orfv在免疫調(diào)節(jié)和肝胰腺組織中的調(diào)節(jié)作用ORFV在首次感染痊愈后能使宿主發(fā)生再感染,它很可能是通過病毒編碼的一些毒力因子的作用使機(jī)體的免疫力降低。對(duì)ORFV致病機(jī)制的研究近年來取得了較大的進(jìn)展,Delhon等認(rèn)為ORFV編碼產(chǎn)生的IFNR、IL-10、CBP、GIF和VEGF等一些對(duì)宿主有致病性的毒力因子和有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子在ORFV致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用,它們主要通過干擾和或破壞宿主的免疫反應(yīng)使機(jī)體的免疫力下降,從而引起宿主發(fā)病。McInnes等(2005)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),IL-10和一種雙鏈RNA結(jié)合蛋白(IFNR)一起具有抑制干擾素的作用。Fleming等(Bruce等,2003)證實(shí)ORFV編碼產(chǎn)生的趨化因子結(jié)合蛋白(CBP)與C-和CC-趨化因子有高度的親和性,它能與趨化因子表面的受體結(jié)合位點(diǎn)上的氨基酸殘基結(jié)合。CBP與炎癥反應(yīng)相關(guān)的CC-趨化因子(MCP-1、MIP-1α和RANTES)等結(jié)合后,能抑制單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞向感染部位聚集。此外,還能與C-趨化因子中的淋巴細(xì)胞趨化因子(能表達(dá)淋巴細(xì)胞趨化因子受體XCR1的T細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和B細(xì)胞)相結(jié)合發(fā)揮作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),ORFVCBP還能聚集一些對(duì)Th1細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)選擇性地抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。Mercer等(Savory等,2000)證實(shí)在病毒感染早期,被大量轉(zhuǎn)錄生成的VEGF是一種重要的毒力因子,它主要引起血管的高度擴(kuò)張和表皮的強(qiáng)烈增生。因此,對(duì)這些毒力因子的研究將為宿主如何對(duì)抗病毒感染提供新思路。5采用實(shí)時(shí)pcr方法檢測orfvORFV的檢測可根據(jù)典型的臨床癥狀、流行情況作出初步診斷,然而由于ORFV與其他一些病原(如口蹄疫病毒、羊痘病毒和藍(lán)舌病病毒)感染后的臨床癥狀非常相似,尤其是細(xì)菌繼發(fā)感染或混合感染時(shí)將增加臨床診斷工作的難度。因此確診需要通過電鏡負(fù)染、血清學(xué)方法、動(dòng)物接種等方法進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。研究證實(shí)了這些方法的可行性,然而ORFV在免疫上的特殊性使得對(duì)其檢測還沒有完整的和特異性的方法。Becher等(2002)、Yasuo等(2002)、Einar等(2002)采用PCR方法檢測ORFV,結(jié)果表明該方法的靈敏性和特異性均較高。Nitsche等(2006)首次建立了用于副痘病毒檢測的實(shí)時(shí)PCR檢測方法,用該方法對(duì)臨床上分離的41株病毒株進(jìn)行檢測的結(jié)果表明,其靈敏性和特異性均較高,與其他病毒不存在交叉反應(yīng)性,最低能檢出4.7個(gè)拷貝數(shù)的病毒粒子。目前,建立一種有效、快速的分子生物學(xué)檢測方法成為該病的研究熱點(diǎn)之一。羊傳染性膿皰皮炎目前尚無有效的治療藥物,疾病處于自限性時(shí),通常使用抗生素阻止細(xì)菌繼發(fā)感染;處于并發(fā)癥時(shí),常使用局部冷敷療法或切除法;疾病較為嚴(yán)重時(shí),可進(jìn)行必要的切除(Degraere等,1994)。對(duì)該病進(jìn)行免疫預(yù)防時(shí)常使用滅活苗和弱毒苗,它們雖然能在一定程度上降低感染的嚴(yán)重性,但是并不能完全阻止疾病的發(fā)生。ORFV在免疫上的特殊性使得還沒有有效的疫苗用于該病的免疫預(yù)防。目前世界各國正加緊進(jìn)行病毒基因工程苗的研究工作(Anderson等,2001;Mazur等,2