11種植物提取物對4種病原細菌的抑菌活性篩選

\o"11種植物提取物對4種病原細菌的抑菌活性篩選"11種植物提取物對4種病原細菌的抑菌活性篩選植物源殺菌劑含有選擇性高、環(huán)境和諧、對非靶標生物安全、低毒、低殘留等優(yōu)點，從植物中尋找抑菌活性物質(zhì)，是研發(fā)新型殺菌劑的熱點之一。現(xiàn)在，中國開發(fā)與應(yīng)用的植物源殺菌劑重要有苦參堿、黃岑苷、小檗堿、丁子香酚、香芹酚、兒茶素、大蒜素、乙蒜素、大黃素甲醚等。但前述產(chǎn)品多集中于對植物真菌病害的防治，對植物源殺細菌劑的研究大多側(cè)重于食品污染菌的控制，且大多數(shù)還處在室內(nèi)篩選階段。魏希穎等研究發(fā)現(xiàn)泡桐花提取液對金黃色葡萄球菌有很強的克制作用。葉舟測定了木麻黃（CasuarinaequisetifoliaForst）小枝提取液的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌體現(xiàn)出較強的克制活性。崔彥等的研究證明五倍子、丁香、地榆對黃瓜細菌角斑病菌體現(xiàn)出明顯的克制作用，其中五倍子提取物的活體防效可達60%，含有一定的開發(fā)潛力。李玉玲發(fā)現(xiàn)竹焦油對甘藍黑腐病菌、番茄細菌性斑點病菌、茄青枯病菌等多個供試細菌都有不同程度的克制活性。為了獲得對植物細菌病害有廣泛抑菌譜的植物源物質(zhì)，本研究選用已報道過的含有廣泛抑菌活性的11種植物提取物，對魔芋軟腐病菌、獼猴桃潰瘍病菌、核桃黑斑病菌、白菜軟腐病菌4種常見的病原細菌進行室內(nèi)抑菌活性篩選，旨在為新型植物源殺細菌劑的開發(fā)研究提供線索。1材料與辦法

1.1材料

1.1.1供試菌種魔芋軟腐病菌（Erwiniacarotovorapv.carotovora）、獼猴桃潰瘍病菌（Pseudomonassyringaepv.actinidiae）、白菜軟腐病菌（Erwiniacarotorora）均由西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心提供；核桃細菌性黑斑病菌（Xanthomonascampestrispv.juglandis）由西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院提供。

1.1.2供試植物源物質(zhì)及試劑大黃提取物（其中大黃素含量為0.30%）、博落回提取物（其中血根堿含量為0.57%）、狼毒提取物（其中狼毒素含量為1.90%）、皂莢提取物（其中皂莢素含量為6.90%）、苦參提取物（其中苦參堿含量為2.15%）均由山西德威生化有限公司提供。90%的小檗堿、蛇床提取物（其中蛇床子素的含量為10%）、藜蘆生物堿（其中藜蘆胺含量為2.30%）、98%的肉桂酸、98%的丁香酚、98%的檸檬酸銅均由西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心提供。72%的農(nóng)用鏈霉素購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。丙酮、葡萄糖、瓊脂粉、氯化納、胰蛋白胨、酒精、牛肉膏、酵母粉均購于陜西天成化玻有限公司。

1.2辦法

1.2.1培養(yǎng)基配制辦法室內(nèi)生測用于細菌性病原菌的培養(yǎng)與保存的固體培養(yǎng)基（NA）：稱取瓊脂粉15g、

蛋白胨5g、牛肉膏3g，加水至1L，滅菌鍋滅菌待用；用于活化細菌性病原菌菌株的液體培養(yǎng)液（LB）：稱取胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化鈉3g，加水至1L，滅菌鍋滅菌待用。

1.2.2藥劑配制采用對供試病菌沒有抑菌作用的丙酮作為溶劑，將供試植物源物質(zhì)溶解。用20%丙酮-水溶液將各植物源提取物或化合物按其有效成分含量溶解稀釋成2000μg/mL藥液（作為母液備用）。用無菌水將各母液分別依次2倍稀釋最后擬定為1000、500、250、125、62.5μg/mL5個濃度梯度解決，均以濃度為200μg/mL的72%農(nóng)用鏈霉素作藥劑對照，采用對供試細菌沒有抑菌作用的20%丙酮-水溶液作為空白對照，每個解決重復(fù)3次，以減少誤差。

1.2.3供試菌種的準備將供試菌種在實驗前1d轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)液中，置于28℃恒溫搖床箱中活化12h。用無菌水調(diào)配成菌液濃度為1×106CFU/mL，以供室內(nèi)抑菌活性篩選使用。

1.2.4瓊脂擴散法室內(nèi)抑菌活性篩選辦法采用瓊脂擴散法進行室內(nèi)抑菌活性篩選，將溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基冷卻至45～50℃，加入活化好的細菌數(shù)量不不大于106CFU/mL的供試菌懸液搖勻（成帶菌培養(yǎng)基）。每次取15mL的帶菌培養(yǎng)基，分別倒入直徑為9cm的玻璃培養(yǎng)皿中，制成帶菌平板。待冷卻后用直徑為9mm的打孔器在平板上均勻打3個孔，并用接種針挑出孔中培養(yǎng)基，在每孔內(nèi)加入75μL配好的供試植物源物質(zhì)，以200μg/mL的農(nóng)用鏈霉素作為藥劑對照，并以丙酮作為溶劑對照，每組解決重復(fù)3次。置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察成果，用直尺按十字交叉法測量抑菌圈直徑（減去孔徑9mm）求取平均值，進行比較。

1.2.5最低有效克制濃度（MIC）的測定辦法采用二倍稀釋法測定待測植物源物質(zhì)的MIC值，取編號為1～11的試管以及適量的蒸餾水，放入滅菌鍋里滅菌待用。滅菌完畢后，取無菌試管，分別往試管內(nèi)加入2mL無菌水。將2mL濃度為2000μg/mL待測藥液加入1號試管中，搖勻后，將混合后的藥液2mL加入2號試管中，依次操作到10號管為止，棄掉10號管中的2mL藥液，使各個試管中的藥液體積同樣，將11號管設(shè)為空白對照，加入同等含量丙酮的水溶液。每種病菌設(shè)3組重復(fù)解決。最后將稀釋好的細菌數(shù)量達104CFU/mL的病原菌菌懸液2mL分別加入1～11號試管中，置于適宜的溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待空白對照試管菌液出現(xiàn)渾濁，觀察成果，進行比較。成果判斷：由于菌液與藥液等量混合，相稱于將藥液二倍稀釋，最后待測藥液為10個濃度梯度，分別為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、1.8、0.9μg/mL。

成果觀察：通過肉眼比對發(fā)現(xiàn)試管內(nèi)液體澄清透明經(jīng)震蕩后仍無沉淀產(chǎn)生，則此試管對應(yīng)的藥液濃度即為此藥劑看待測病菌的MIC值。

1.3數(shù)據(jù)分析

運用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2成果與分析

2.111種植物提取物對4種病原細菌的室內(nèi)抑菌活性篩選

2.1.1魔芋軟腐病菌的室內(nèi)抑菌活性篩選采用瓊脂擴散法測定了11種植物提取物對魔芋軟腐病菌的克制活性，成果表明，供試11種植物提取物對魔芋軟腐病菌的克制效果有明顯的差別。大黃、狼毒、博落回提取物、小檗堿、肉桂酸和藜蘆生物堿6種植物提取物對魔芋軟腐病菌都有不同程度的克制作用（表1），皂莢、苦參、蛇床提取物及丁香酚、檸檬酸銅對魔芋軟腐病菌則無明顯克制效果。由表1可看出，博落回提取物對魔芋軟腐病菌的克制作用最強，濃度在1000μg/mL時，抑菌圈直徑最高達（19.3±0.30）mm；另首先是大黃、狼毒提取物，抑菌圈直徑分別為（17.3±0.48）、（11.9±0.26）mm，均高于或相稱于對照藥劑農(nóng)用鏈霉素200μg/mL的抑菌圈直徑（12.6±0.26）mm；同時，小檗堿、藜蘆生物堿的抑菌圈直徑也達成了（10.0±0.26）、（10.1±0.34）mm，對魔芋軟腐病克制作用較好；肉桂酸僅有微弱抑菌活性，其1000?g/mL解決抑菌直徑僅（0.3±0.10）mm。

2.1.2獼猴桃潰瘍病菌的室內(nèi)抑菌活性篩選通過對獼猴桃潰瘍病菌的室內(nèi)活性篩選成果表明（表2），在濃度為1000μg/mL時，大黃和狼毒提取物抑菌圈直徑分別為（13.3±0.47）、（12.2±0.32）mm，均不不大于對照藥劑農(nóng)用鏈霉素濃度在200μg/mL時的抑菌圈直徑（12.0±0.18）mm；博落回、皂莢、苦參、蛇床提取物對病原菌克制作用次之，最大抑菌圈直徑在6.7～9.8mm之間；檸檬酸銅的最大抑菌圈直徑為（0.2±0.00）mm，抑菌作用較弱；小檗堿、丁香酚、肉桂酸以及藜蘆生物堿則無明顯克制效果，故在表2中未列出。2.1.3核桃黑斑病菌的室內(nèi)抑菌活性篩選從表3成果可看出，蛇床子提取物對核桃黑斑病菌的抑菌作用最佳，在濃度為1000g/mL時，抑菌直徑達成（12.7±0.13）mm，另首先是苦參提取物，抑菌圈直徑為（10.0±0.23）mm。皂莢提取物、丁香酚、肉桂酸對核桃黑斑病菌也有一定的克制作用。大黃、博落回、狼毒提取物、小檗堿、檸檬酸銅以及藜蘆生物堿對核桃黑斑病菌無克制作用，在表3中未列出。而藥劑對照鏈霉素在200?g/mL時抑菌圈直徑達（17.0±0.58）mm。由此表明，這11種植物提取物對核桃黑斑病菌克制作用不明顯。

2.1.4白菜軟腐病菌的室內(nèi)抑菌活性篩選實驗成果（表4）表明，在11種供試植物提取物中，僅苦參提取物、丁香酚和肉桂酸對白菜軟腐病菌有抑菌作用，而大黃、博落回、狼毒、蛇床子提取物、小檗堿、檸檬酸銅、藜蘆生物堿及皂莢提取物對白菜軟腐病菌無明顯克制作用，在表4的抑菌活性篩選的成果中未列出；苦參提取物、丁香酚和肉桂酸對白菜軟腐菌都有一定的克制作用但不明顯，其最大的抑菌圈直徑均比對照藥劑農(nóng)用鏈霉素在200?g/mL時的抑菌圈直徑小。

2.2抑菌活性較好的植物源物質(zhì)的MIC測定成果

2.2.15種植物提取物對魔芋軟腐病菌的MIC測定成果由表5可知，大黃和博落回提取物對魔芋軟腐病菌的MIC值分別為7.8、15.6?g/mL，均明顯低于對照農(nóng)用鏈霉素的MIC值31.3?g/mL。狼毒提取物、小檗堿和藜蘆生物堿的MIC值分別為125、62.5、250?g/mL，體現(xiàn)出一定的抑菌活性，與表1的抑菌圈實驗成果基本一致。綜合表1和表5可知，大黃和博落回提取物對魔芋軟腐病菌的抑菌作用最為明顯，有進一步研究的潛力。同等含量丙酮的水溶液對魔芋軟腐病菌的MIC值無影響。

2.2.26種植物提取物對獼猴桃潰瘍病菌的MIC測定成果從表6可知，大黃提取物對獼猴桃潰瘍病菌的MIC值與對照農(nóng)用鏈霉素均為3.9?g/mL，表明獼猴桃潰瘍病菌對大黃提取物比較敏感。另首先苦參和狼毒提取物的MIC值均達成15.6?g/mL，皂莢和博落回提取物分別為31.3、250?g/mL，與表3的抑菌活性篩選成果基本相似。結(jié)合表5～6可看出，大黃、博落回和狼毒提取物對魔芋軟腐病菌和獼猴桃潰瘍病菌都有明顯的克制作用，體現(xiàn)出廣譜的抑菌活性。同等含量丙酮的水溶液對獼猴桃潰瘍病菌的MIC值無影響。

2.2.33種植物提取物對核桃黑斑病菌的MIC測定成果由表7可見，核桃黑斑病菌對農(nóng)用鏈霉素最敏感，其MIC值為7.8?g/mL。皂莢、苦參和蛇床子、提取物的MIC值分別為15.6、31.3、15.6?g/mL，也體現(xiàn)出較好的抑菌活性。同等含量丙酮的水溶液對核桃黑斑病菌的MIC值無影響。

3討論

本研究采用瓊脂擴散法、二倍稀釋法對11種植物提取物對魔芋軟腐病菌、獼猴桃潰瘍病菌、白菜軟腐病菌、核桃細菌性黑斑病菌4種病原細菌的抑菌活性進行了研究。成果表明大黃、博落回和狼毒提取物均含有明顯克制植物病原細菌的活性，有開發(fā)為新型植物源殺細菌劑的潛力。其中，大黃提取物對魔芋軟腐病菌和獼猴桃潰瘍病菌的克制效果最為突出；博落回提取物對魔芋軟腐病菌、狼毒提取物對獼猴桃潰瘍病菌、蛇床提取物對核桃黑斑病菌的MIC均在20?g/mL下列，與對應(yīng)的對照藥劑農(nóng)用鏈霉素的MIC值相稱，有明顯的抑菌活性?？鄥?、蛇床子和皂莢提取物對特定病菌有良好的克制活性，在殺細菌應(yīng)用上有研究的價值。

狼毒、大黃和博落回提取物在抗細菌作用方面的研究甚少，且多集中于醫(yī)藥、食品研究。前人的=研究表明，狼毒石油醚提取物的殺煙蚜活性最佳；瑞香狼毒提取物對小菜蛾、枸杞蚜蟲有十分明顯的毒殺活性。南蘋瑤等發(fā)現(xiàn)大黃乙醇提取物對大腸埃希菌ATCC25922的體外抑菌作用明顯。Hazni等研究成果顯示，大黃素對金黃色葡萄球菌、溶血溶血性鏈球菌、肺炎球菌、白喉桿菌、炭疽桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、變形桿菌等都有較強的克制作用；李文娟研究證明瑞香狼毒（StellerachamaejasmeL.）乙酸乙酯萃取物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最明顯，其最低抑菌濃度和最低殺菌濃度為0.63mg/mL；郁建平研究發(fā)現(xiàn)鹽酸血根堿含有很強的廣譜抑菌作用，對木霉、根霉、黃曲霉、黑曲霉、米曲霉、毛霉、酵母的最低抑菌濃度均低于40?g/mL。楊軍輝等發(fā)現(xiàn)牛角瓜根的石油醚粗提物對枯