山西灰霉病菌的抗性及防治對策

山西灰霉病菌的抗性及防治對策

灰霉菌是一種嚴(yán)重的世界疾病，尤其是各種園藝作物的破壞。這種疾病主要影響水果和花朵，因此在生產(chǎn)上會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。其病原灰葡萄孢BotrytiscinereaPers.是一種重要的弱寄生植物病原菌,其寄主范圍很廣,至少可以侵染235種植物,引起多種作物的灰霉病?，F(xiàn)已成為山西露地和保護地蔬菜的主要病害,近幾年發(fā)生和為害呈現(xiàn)逐年加重的趨勢。長期以來生產(chǎn)上主要靠化學(xué)防治控制其為害,但灰霉病菌具有繁殖速率高、遺傳變異大和適合度高的特性,多年連續(xù)大量使用化學(xué)藥劑使得這種病原菌對一些殺菌劑已產(chǎn)生了抗性,田間普遍反映常用殺菌劑的防治效果下降,菜農(nóng)不得不加大殺菌劑用量和增加使用次數(shù)來進行防治,保護地蔬菜從定植開始幾乎每周噴灑一次殺菌劑,也難以收到良好的防治效果。這樣不僅大幅度增加了蔬菜生產(chǎn)成本,而且造成了蔬菜和環(huán)境的嚴(yán)重污染,直接影響了消費者的身心健康。因此,山西灰霉病菌是否產(chǎn)生抗藥性,抗性頻率和抗性水平如何,應(yīng)采取什么治理對策,已是蔬菜生產(chǎn)上亟待解決的問題。作者于1998～2002年對采自山西省不同地區(qū)的灰霉病菌對常用殺菌劑多菌靈的抗性進行了監(jiān)測,明確了各地的抗性程度及抗性頻率,對生產(chǎn)上合理用藥具有一定的指導(dǎo)意義。1材料和方法1.1省劃分及劃分根據(jù)各地區(qū)在蔬菜生產(chǎn)中對灰霉病進行化學(xué)防治的總體用藥歷史和用藥水平,將山西省劃分為四大地區(qū)進行調(diào)查:晉中地區(qū)(包括晉中、太原、呂梁三個行政地區(qū))、晉南地區(qū)(臨汾和運城兩個行政地區(qū))、晉東南地區(qū)(長治和晉城兩個行政地區(qū))和晉北地區(qū)(忻州、朔州和大同三個行政地區(qū))。在各調(diào)查區(qū)內(nèi)保護地蔬菜進行廣泛的采樣。1.2根據(jù)測定內(nèi)容進行取樣被調(diào)查的灰霉菌樣取自保護地主要作物番茄、黃瓜和西葫蘆的罹病果實或花托,按照隨機取樣的原則進行。取樣后將各病組織分別裝入小袋或小瓶中使其彼此隔離,以防不同菌株間相互污染。病組織帶回后對病菌進行分離、純化、及單孢分離,并立即進行抗性測定。菌株以“采樣地點(市或縣)的小寫拼音字頭(聲母)+序號”命名。1.3試驗試劑97.3%多菌靈原粉,由山東雙星農(nóng)藥廠提供。1.4tween80的添加97.3%多菌靈原粉用0.1N稀HCl配成5000μg·mL-1母液,以0.2%的量加入乳化劑Tween80。母液在4℃冰箱中貯藏,用時以無菌水稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?以不大于10%的藥液量加入熔化的PDA培養(yǎng)基中充分搖勻,制成含最終所需濃度藥量的PDA平板,用以進行抗藥性鑒定和抗藥性水平測定。1.5生長抗菌材料的篩選用MIC法(最低抑制濃度法),鑒別濃度采用Yarden的標(biāo)準(zhǔn),多菌靈以0.5μg·mL-1、50μg·mL-1鑒別敏感、中抗和高抗,即不能在含藥0.5μg·ml-1的平板上正常生長的為敏感菌株,能在0.5μg·mL-1上正常生長但EC50值小于50μg·mL-1為中抗菌株,EC50值大于50μg·mL-1為高抗菌株。經(jīng)分離純化的新鮮病菌,取直徑5mm的菌塊接種于含鑒別濃度的PDA平板上,在(20±1)℃培養(yǎng)48h后,觀察生長情況。統(tǒng)計各調(diào)查地區(qū)的敏感和抗性菌株的發(fā)生頻率。1.6抗菌性菌株對多菌靈表現(xiàn)敏感(S)、中抗(RM)或高抗(R)類型。1.7生長抑制率測定采用FAO推薦的菌落直徑法。對多菌靈的敏感與抗性菌株各隨機選取若干代表菌株,在含藥平板上進行毒力測定。毒力測定設(shè)置5～7個梯度濃度,以不加藥劑為對照;每濃度重復(fù)3皿。各濃度設(shè)置如下(單位為μg·mL-1):多菌靈的敏感菌株為0.02、0.03、0.04、0.06、0.08,中抗菌株為2.5、5、10、15、20、25、40,高抗菌株為50、100、200、400、800、1000、1500,在灰霉菌的菌落生長邊緣打取直徑為5mm的菌塊,接種于各藥劑濃度的平板上,在20℃黑暗培養(yǎng)48h,測量菌落直徑。根據(jù)菌落在不同濃度藥劑的平板上生長抑制率,用SAS軟件計算抑制中濃度EC50值和EC90值。各取平均后,計算抗性菌株EC50值與敏感菌株EC50值之比,即得相應(yīng)的抗藥性倍數(shù)。2結(jié)果與分析2.1灰霉病菌的抗性特征在山西省4個調(diào)查地區(qū)的22個市縣,共采集并成功分離到188個灰霉菌株,其中晉南地區(qū)86個,晉中地區(qū)50個,晉東南地區(qū)31個,晉北地區(qū)21個。在室內(nèi)對各菌株進行了抗藥性鑒定,共得到多菌靈的敏感菌株20個,中抗菌株74個,高抗菌株94個;各地區(qū)灰霉病菌的抗藥性頻率有一定的差異。由表1可見,晉中地區(qū)的灰霉菌對多菌靈的抗性頻率為86.0%;以中抗菌株為主,占群體的58.0%;晉南和晉東南地區(qū)總體抗藥性水平都較高,抗性菌株分別占到87.2%和93.5%;而敏感菌株分別只有12.8%和6.5%,多菌靈的抗性菌株占絕對優(yōu)勢;晉北地區(qū),所測菌株全部為多菌靈的抗性菌,其中以中抗菌株為主,占66.7%。從以上4個地區(qū)的測試結(jié)果可以看出灰霉菌株抗多菌靈的抗性菌株在病菌群體中占有相當(dāng)大的比例,對多菌靈的抗性頻率均達到86.0%以上,因此用此藥防治該病已基本無效,起不到應(yīng)有的防治作用。2.2抑菌活性測試從總體上看(圖1),山西各地灰霉菌對多菌靈已不同程度產(chǎn)生了抗藥性,但在各地區(qū)的抗性情況不相同。多菌靈總體抗性頻率達到89.4%,其中中抗菌株占有相當(dāng)大的比例,為39.4%,高抗菌株為50.0%,僅有10.7%的測試菌株表現(xiàn)為敏感。在晉中、晉東南和晉北地區(qū),中抗菌株比例較高,均在50%以上,而晉南地區(qū)高抗菌株的比例更大,達到69.4%,表明晉南地區(qū)對多菌靈的抗性最為嚴(yán)重。2.3抗菌菌株的ec50,ec29多菌靈的毒力測定結(jié)果顯示:敏感菌株的平均EC50值為0.0428μg·mL-1,EC90值為0.1280μg·mL-1(表2);中抗菌株的平均EC50值為11.2415μg·mL-1,EC90值為128,4351μg·mL-1(表3)。中度抗性菌株的抗性倍數(shù)為262.7倍。由于大多數(shù)高抗菌株的抗性太高,無法測得其EC50值,但實驗表明,EC50值均大于50μg·mL-1,且大部分高抗菌株EC50值大于100甚至500μg·mL-1,即抗性倍數(shù)在1000倍以上。3結(jié)論和討論3.1養(yǎng)菌劑的應(yīng)用灰霉病菌對多菌靈的抗藥性在山西省范圍內(nèi)普遍較嚴(yán)重。其中,晉南和晉東南的抗性程度相當(dāng);晉中地區(qū)輕于前二者,晉北地區(qū)最輕。根據(jù)我國對多菌靈的用藥歷史和藥劑特性,抗性發(fā)生有一定的規(guī)律。從對山西省調(diào)查結(jié)果看,其灰霉菌的抗性與我國總體情況基本一致。多菌靈在山西省晉南、晉東南及晉中地區(qū)防治灰霉病基本已無效,在晉北應(yīng)需慎重使用。3.2ec50值的變化田間的灰霉菌株對多菌靈發(fā)生抗藥性突變其程度呈梯度變化,即從中低抗到高抗,其EC50值連續(xù)性增大。中抗菌株的抗性倍數(shù)為11.24倍,高抗菌的倍數(shù)則變化范圍很大,且大多數(shù)在1000倍以上?？剐詸C理研究表明,苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性是由一個主效基因控制的,所以一旦產(chǎn)生突變,其抗性程度會達到很高的水平。3.3測定結(jié)果可靠性分析抗性檢測結(jié)果的可靠性與采集的菌株數(shù)、菌樣的代表性(即取樣隨機性)及測定方法三者直接相關(guān)。由于灰霉病在保護地的發(fā)生很普遍,這給監(jiān)測中的采樣調(diào)查帶來很大便利。所以,在山西省共測定了188個菌株,得出的結(jié)果可靠性較高。相比之下,晉北地區(qū)所采得的菌樣較少,所以其結(jié)論的準(zhǔn)確性較差。特別是在該地區(qū)未檢測到多菌靈的敏感菌株,并不能確定晉北地區(qū)沒有此類型。3.4抗性ec50本實驗中用測定MIC法進行抗藥性的鑒定,這是國際上最常用的方法,操作簡單而結(jié)果可靠。但國內(nèi)外大量研究中,抗性鑒定方法不同。也有人按照抗性水平的普遍定義,根據(jù)