基礎化學第十四章-現(xiàn)代儀器分析簡介

第十四章現(xiàn)代儀器分析簡介緒言儀器分析：以物質(zhì)的物理性質(zhì)或物理化學性質(zhì)為基礎，分析物質(zhì)的化學組成、含量、化學結(jié)構。微量/痕量，超微量/超痕量一、儀器分析方法分類（1）光譜分析（2）電化學分析（3）色譜分析（4）熱分析（5）質(zhì)量分析第一節(jié)光譜分析基礎一、電磁輻射和電磁波譜（一）電磁輻射高速通過空間傳播的光子流（簡稱為光）波粒二象性：波動性，粒子性普朗克公式：光子能量E＝hn，h=6.626×10-34Js,Plank常數(shù)n為光的頻率。光譜法原子光譜法光譜法分子光譜法吸收光譜法發(fā)射光譜法

ΔE=E2-E1=hυ二、原子光譜和分子光譜原子光譜：原子核外電子在不同能級間躍遷產(chǎn)生的光譜。是一些分離的特征銳線。頻率吸光系數(shù)特點：線光譜原子軌道

n,l,m

三個量子數(shù)

n,l,m電子運動狀態(tài)主量子數(shù)角量子數(shù)磁量子數(shù)鈉（11Na）原子基態(tài)鈉原子：1s22s22p63s13s1：n=3l=0m=0ms

=+1/2激發(fā)態(tài)鈉原子：1s22s22p64s1能量E0能量Ej能量Ej能量

E0基態(tài)激發(fā)態(tài)hυ(吸收輻射)ΔE=|Ej

-E0

|=hυ特點：線光譜能量E0能量Ej2能量Ej1ΔE1=Ej1-E0υ=|En2-En1|/h

=hυ1ΔE2=Ej2-E0=hυ2同一原子不同的原子不同的ΔEΔE=Ej-E0=hυ原子光譜法原子吸收光譜法原子發(fā)射光譜法原子熒光法（二）分子光譜

電子在分子內(nèi)不同能級間躍遷產(chǎn)生的光譜。分子能量E=En+Et+

Ee

+

Ev

+

Er核能變化小電子能振動能轉(zhuǎn)動能平動能電子能級n=1n=243210振動能級4321043210轉(zhuǎn)動能級43210轉(zhuǎn)動能級ΔE=E2-E1=(Ee

+

Ev

+

Er)2-(Ee

+

Ev

+

Er)1=ΔEe

+ΔEv

+ΔEr

=hυ

1-20ev1.25um-60nm紫外-可見光

0.025-1ev50-1.25um近、中紅外

10-4-0.025ev1.25cm-50um遠紅外、微波電子光譜振動光譜轉(zhuǎn)動光譜特點：帶狀光譜分子光譜電子光譜振動光譜轉(zhuǎn)動光譜紫外-可見分光光度法分子熒光分子磷光分子光譜分光光度法（spectrophotometry）根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜及光的吸收定律進行定性、定量分析的一種方法。紫外分光光度可見分光光度紅外分光光度10nm200nm380nm780nm3105nm第二節(jié)紫外-可見光譜法是對分子內(nèi)電子躍遷產(chǎn)生的吸收光譜進行分析的一種常用光譜分析法。分子或離子對某一波長范圍的光有吸收，根據(jù)吸收光譜進行定性、定量分析。常規(guī)分析中，50%的定量分析用到紫外-可見分光光度法。紫外-可見分光光度法的特點：1準確度：誤差1-3%2儀器：普及，價廉3適應性：應用于各行業(yè)4選擇性：優(yōu)于普通容量、滴定分析5靈敏度：10-6g/ml單一波長的光——單色光不同波長組成的光——復色光白光：紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等顏色的光按一定強度比例混合而成互補色：同一直線上的兩種顏色380~450nm650~780nm600~650nm580~600nm500~580nm490~500nm480~490nm450~480nm一、紫外-可見吸收光譜（一）物質(zhì)對光的選擇性吸收4005006001.00.80.60.40.20Aλ/nm三(鄰二氮菲)合鐵(II)離子的吸收光譜c2c4c其它條件相同最大吸收波長λmax帶狀光譜吸收光譜電子能級n=1n=243210振動能級43210ΔE=E2-E1=hυππ*σσ*成鍵軌道非鍵軌道反鍵軌道nσ*nπ*ΔE減小ΔE=E2-E1=hυσ*π*

n

πσ三種與紫外-可見吸收光譜有關的電子：σ電子π電子n電子（二）有機化合物紫外-可見吸收σσ*nσ*飽和有機物，真空紫外區(qū)含有雜原子飽和烴衍生物，真空紫外區(qū)λ<200nmΔE=E2-E1=hυππ*nπ*含有雜原子的不飽和有機物具有不飽和鍵的有機物εmax小εmax大具有共軛雙鍵結(jié)構的有機分子（在近紫外區(qū)（200-380nm）和/或可見光區(qū)（380-780nm）有吸收）共軛程度增加，ΔE降低吸收峰波長紅移對光的吸收能力增強（三）無機化合物的紫外-可見吸收當過渡金屬離子處于配位體形成的負電場中時，5個簡并的d軌道發(fā)生能級分裂。中心原子d軌道在正八面體場中的能級分裂棕紅色在外來輻射激發(fā)下，d電子發(fā)生d-d躍遷

ΔE=Δo=hυ分裂能二、Lambert-Beer定律（吸收定律）（一）透射比（T）和吸光度（A）I0ItIa=TI0=Ia

+ItItI0入射光強透射光強吸收光強A=-lgT=lgI0It（二）Lambert-Beer定律Lambert定律當c一定時，對均勻介質(zhì)A

b（液層厚度，cm）A=k1bk

被測物質(zhì)性質(zhì)、入射光波長、溶劑、溶液濃度及溫度有關Lambert定律當b、

一定時A

c（濃度，mol

L-1）A=k2cA=

bc

摩爾吸光系數(shù)（L

mol-1

cm-1）

c物質(zhì)的量濃度A=

ab

a（質(zhì)量）吸光系數(shù)（L

g-1

cm-1）

質(zhì)量濃度

=aM

Lambert-Beer定律（僅適用單色光）

愈大，測定愈靈敏，通常

>103物質(zhì)對某一波長光的吸收能力b（液層厚度，cm）例：已知某化合物的相對分子質(zhì)量為251，將此化合物配成濃度為0.150mmol

L-1的溶液，在480nm處用2.00cm吸收池測得透光率為39.8%，求

、a

解：A=

bc三、紫外-可見分光光度計（一）主要部件的性能與作用光源：提供激發(fā)能，使待測分子產(chǎn)生吸收，單色器：使光源發(fā)出的光變成所需要的單色光，吸收池：用于盛放試液，檢測器：光電轉(zhuǎn)換器（光電管）。光源單色器

吸收池檢測器

1.光源（連續(xù)光譜）鎢燈：320-2000nm，可見及近紅外區(qū)氫、氘燈：190-350nm，紫外區(qū)2.單色器（分光系統(tǒng)）棱鏡：光的折射率光柵：光的衍射3.吸收池玻璃可見光區(qū)石英紫外光區(qū)1cm,0.5cm,5cm空白液被測液毛細管儀器類型：1.單波長單光束型2.單波長雙光束型3.雙波長分光光度計1.單波長單光束分光光度計可變波長單光束紫外-可見分光光度計示意圖2.單波長雙光束分光光度計參比池檢測器濾光片或單色器放大器樣品池光源

hv光子檢測器反光鏡反光鏡透明部分扇形鏡正面圖扇形鏡反光鏡柵鏡雙光束型可以消除光源強度變化的影響.四、參比溶液a.溶劑參比b.試劑參比：溶劑+試劑+顯色劑

橙色

無色四、參比溶液c.樣品參比（試樣參比）：溶劑+試劑+樣品d.平行操作參比：藥代分析，測血液中藥物的含量。五、測定方法(一)標準曲線法

一定（通常為

max）c1、c2、c3、c4-----cA1、A2、A3、A4----A(二)標準對照法已知(標準)As=

b

cs未知(待測)Ax=

b

cx相除得（三）雙波長分光光度法兩種組分（a為干擾組分，b為被測組分）共存時，其吸收光譜相互重疊。采用雙波長測定：λ1：A1=A1a+A1b+A1s

λ2：A2=A2a+A2b+A2sA1s=A2s

（背景吸收，與波長關系不大）ΔA=（A2a-A1a）+（A2b-A1b）當A2a=A1a時，ΔA=A2b-A1b=(ε2b–ε1b)Lc1、溶液偏離Beer定律引起的誤差（1）化學因素吸光物質(zhì)不穩(wěn)定，發(fā)生解離、締合等。（2）光學因素分光光度計得到的是一個狹小波長范圍六、提高測量靈敏度和準確度的方法（一）分光光度法的誤差光源單色器

吸收池檢測器

通常取

max六、提高測量靈敏度和準確度的方法（一）分光光度法的誤差2、儀器測定誤差=Δcc0.4343ΔTTlgT適宜的吸光度范圍：吸光度0.2-0.7六、提高測量靈敏度和準確度的方法（一）分光光度法的誤差（二）選擇適當?shù)娘@色劑若溶液無色有色溶液，此過程為顯色顯色劑的要求：靈敏度高選擇性好生成物確定的組成生產(chǎn)物穩(wěn)定顯色劑在測定波長處無吸收

顯色劑顯色劑用量：一般過量如Fe3++SCN-Fe(SCN)2+Fe(SCN)血紅色通過實驗確定溶液的酸度pH配合物顏色1.8~2.5[(Fe(Sal)]+紫紅4~8[(Fe(Sal)2]-橙色8~11[(Fe(Sal)3]3-黃色>12Fe(OH)3

磺基水楊酸陰離子：Sal七、在醫(yī)學檢驗中的定量分析紫外-可見分光法：最廣泛使用、最有效的手段之一。醫(yī)院常規(guī)化驗：95%[例]雙波長法測定新生兒血清膽紅素（BB）的濃度被測組分：膽紅素（BB）

干擾組分：血紅蛋白（HHB）測定波長的選擇：λ455，

λ575A455=A455(BB)+A455(HHB)A575=A575(HHB)血紅蛋白（HHB）:A455(HHB)=A575(HHB)ΔA

=A455–A575=A(BB)=εlc(BB)第三節(jié)熒光分析法一、分子熒光分析理論基礎（一）概述處于分子基態(tài)單重態(tài)中的電子對（自旋方向相反）中一個電子被激發(fā)，躍遷至激發(fā)單重態(tài)軌道上，再從第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級返回基態(tài)的各振動能級時發(fā)射熒光。單重態(tài)三重態(tài)ST分子基態(tài)激發(fā)態(tài)+hυ(吸收輻射)-hυ分子基態(tài)熒光第三節(jié)熒光分析法一、分子熒光分析理論基礎（一）概述處于分子基態(tài)單重態(tài)中的電子對（自旋方向相反）中一個電子被激發(fā)，躍遷至激發(fā)單重態(tài)軌道上，再從第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級返回基態(tài)的各振動能級時發(fā)射熒光。（二）激發(fā)光譜和熒光光譜1．激發(fā)光譜：固定某一發(fā)射光波長，測定該波長下的熒光發(fā)射強度隨激發(fā)光波長變化的光譜，得到熒光激發(fā)光譜。2.熒光光譜：固定某一激發(fā)光波長，測定熒光發(fā)射強度隨發(fā)射波長變化的光譜，得到熒光光譜。二、熒光分析在醫(yī)學中的應用痕量分析：If=2.3

I0

lc=Kc

：熒光效率I0

：與入射光強度有關

：摩爾吸光系數(shù)l：光程長度使用激光光源，熒光定量分析的靈敏度甚至可達10-14mol/l。使用激光光源的熒光分析法又稱激光誘導熒光。DNA熒光發(fā)光探針：熒光探針在發(fā)光分析中應用廣泛。

DNA（生命遺傳的重要物質(zhì)）分子的定量分析和特異識別對基因組學、病毒學、分子生物學等相關學科的發(fā)展具有十分重要的意義。但生物分子自身的熒光較弱，目前多采用熒光探針法檢測。熒光探針法較傳統(tǒng)的同位素檢測速度快，重復性好，用樣量少，無輻射，在DNA自動測序、抗體免疫分析、疾病診斷、抗癌藥物分析等方面已得到廣泛應用。目前DNA熒光探針的研究熱點：（1）靈敏度（2）避免生物熒光背景的干擾吖啶類熒光探針吖啶類染料是應用最早的核酸熒光探針。機理：通過嵌入或靜電吸引與DNA分子結(jié)合，使DNA的熒光大大增強。吖啶的基本結(jié)構為二苯并吡啶，在水溶液中呈弱堿性。

1940年，發(fā)現(xiàn)當吖啶橙與酸性物質(zhì)連接或存在于酸性物質(zhì)中時，其特征光譜會發(fā)生一定的變化，開始被用于生物體的染色。

吖啶橙可與DNA或RNA作用，與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光激發(fā)/發(fā)射波長為502/538nm。為提高染料穩(wěn)定性及熒光強度，大量的吖啶衍生物被合成。1、10-羧甲基吖啶酯，其熒光及穩(wěn)定性都有很大提高，同時含有的羧基活性基可與生物分子共價結(jié)合。2、吖啶的絡合物，會對DNA序列特異識別，有望成為DNA的轉(zhuǎn)錄抑制劑，控制核酸的表達。熒光素類熒光探針熒光素1：1871年由VonBayer合成，最大吸收/發(fā)射：492/571nm(水中)，量子產(chǎn)率0.92。由于熒光強度大，大量的熒光素衍生物被合成并用作熒光檢測試劑：熒光素2、3、4是應用最廣泛的熒光衍生試劑，用于病毒學、細胞學及免疫組織化學。如將熒光素共價連接到核酸、寡核苷酸、藥物、蛋白質(zhì)及其它分子來合成探針，可用于基因病毒的檢測及表達。分子取向測定：通過熒光偏振的測定，可以獲得分子取向等結(jié)構信息。熒光偏振度：P=(Iz-Ix)/(Iz+Ix)

Iz,Ix分別代表起偏器和檢偏器方向相互垂直和平行時測得的熒光強度。熒光體的偏振度與熒光體的轉(zhuǎn)動速度成反比，熒光體越小，轉(zhuǎn)動速度越快，其偏振度越小。當小分子熒光體連接到大分子蛋白質(zhì)或抗體后，分子轉(zhuǎn)動速度變慢，偏振度增大。熒光偏振可用于免疫檢測。第四節(jié)原子吸收分光光度法

原子吸收光譜法是在本世紀50年代中期逐漸發(fā)展起來的一種新型的儀器分析方法，是元素分析方面的一個常規(guī)武器。光源單色器檢測器原子化器具體操作：1.試樣預處理2.進入原子化器（被測元素原子變成氣態(tài)基態(tài)原子）3.光經(jīng)過原子化器（基態(tài)原子吸收特征譜線）4.分光檢測特征譜線強度的減弱程度5.建立定量關系光源單色器檢測器原子化器一、原子吸收光譜法的基礎理論（一）原子吸收光譜與原子結(jié)構化合物中元素吸收能量(原子化)氣態(tài)基態(tài)原子能量Ej能量

E0基態(tài)激發(fā)態(tài)hυ(吸收輻射)基態(tài)激發(fā)態(tài)hυ(吸收輻射)ΔE=Ej-E0=

hυ吸收線j=1時，ΔE=E1-E0=

hυ0

共振吸收線（特征譜線）基態(tài)第一激發(fā)態(tài)hυ0

最靈敏原子吸收分光光度法的特點：1.選擇性好：元素之間一般無干擾2.靈敏度高：10-6--10-12g/ml（不同的技術決定）3.可分析周期表中70%以上的元素4.分析速度快，幾秒之內(nèi)完成缺點：儀器部件多，操作麻煩原子蒸氣I0ItlIt=

I0e–Klυ吸收光程長度原子吸收系數(shù)被吸收線透射光強入射光強（二）原子吸收的測量1、吸收曲線的面積與吸光原子數(shù)的關系K—υ作圖υKυ~υKυυ0中心頻率υΔυK0K0

2半寬度K0

：峰值吸收系數(shù)峰值吸收測定（Walsh提出）：吸收池內(nèi)被測元素原子濃度和溫度不太高且變化不大時，峰值吸收系數(shù)K0與被測元素基態(tài)原子濃度存在線性關系。A=KcK與實驗條件有關實現(xiàn)峰值吸收測量的條件：提供一種光源（銳線光源）光源中心υ0發(fā)=

υ0吸二、原子吸收光譜儀（原子吸收分光光度計）由光源、原子化器、分光系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)等幾部分組成。光源單色器檢測器原子化器（一）光源（銳線光源）：發(fā)射被測元素的特征譜線空心陰極燈（HCL）（HollowCathodeLamp）組成:陰極(由被測元素材料制成)

陽極(由鈦、鋯、鉭等材料制作)

陰極和陽極封閉在帶有光學窗口的硬質(zhì)玻璃管內(nèi)，管內(nèi)充有惰性氣體氖或氬，其作用是產(chǎn)生離子撞擊陰極，使陰極材料發(fā)光。~-+150-300v陰極材料與被測元素相同鎢棒氖氣（Ne）2Ne→Ne++Ne-~-+150-300v陰極材料與被測元素相同鎢棒氖氣（Ne）2Ne→Ne++Ne-~-+150-300v陰極材料與被測元素相同鎢棒氖氣（Ne）2Ne→Ne++Ne-（二）原子化器：提供能量，使試樣干燥，蒸發(fā)和原子化。使被測元素達到氣態(tài)原子狀態(tài)火焰原子化器無火焰原子化器氫化物發(fā)生原子化器氣體燃燒電加熱（常用管式石墨爐原子化器）氧化還原反應生成氫化物，氫化物分解（三）單色器（分光系統(tǒng)）組成：光柵，反射鏡，狹縫將特征譜線與鄰近譜線分遮擋從原子化器輻射出來的強光（四）檢測系統(tǒng)原子吸收光譜儀中廣泛使用的檢測器是光電倍增管。

V

，cxV

，cxV，溶劑V，標準溶液(cs)三、標準加入法定量分析

V

，cxV

，cxV，溶劑V，標準溶液(cs)Ax

cxAscx+cs=AxcsAs-

Axcx

=加入后：Ax=K×1/2cxAs=K×1/2(cx+cs)加入前：Ax=Kcx

V

，cxV,溶劑V，標準溶液(cs)

V

，cx

V

，cx

V

，cxV，標準溶液(2cs)V，標準溶液(3cs)A1=K×1/2(cx+cs)A2=K×1/2(cx+2cs)A3=K×1/2(cx+3cs)A0=K×1/2cxAn=K×1/2(cx+ncs)An=K×1/2(cx+ncs)Anncscs

2cs3csA3

A2

A1

A0cx四、原子吸收光譜法在醫(yī)學檢驗中的應用生物醫(yī)藥試樣中微量元素的測定微量元素與甲型病毒性肝炎關系的研究微量元素與健康的密切關系。微量元素在人體中的平衡狀態(tài)被打破后,造成體內(nèi)代謝異常,引起一系列的生理變化。如：對病毒性肝炎的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生嚴重影響。研究甲型肝炎病毒感染者與血清中微量元素銅鐵鋅硒的關系：（1）檢測甲型肝炎病毒感染者血清中的微量元素含量。（2）測定血清中微量元素之間比值。研究方法：微量元素測定：抽取被檢者空腹靜脈血5ml，分離血清,置-20℃冰箱凍存?zhèn)錂z。銅鐵鋅測定方法：火焰原子吸收法,硒測定方法：氫化物發(fā)生原子吸收法。統(tǒng)計分析方法：SPSS910統(tǒng)計軟件進行T檢驗、方差分析、組間多重分析、相關分析。結(jié)果：甲肝患者血清中Zn、Se含量明顯低于對照組,統(tǒng)計學檢驗差異有非常顯著性意義(P<0.01)。Fe含量甲肝患者組高于對照組,經(jīng)統(tǒng)計學檢驗差異有顯著性意義(P<0.05)。HAV-IgG

陽性組為獲得免疫性HAV感染者,Cu、Fe、Zn、Se含量與對照組比較,無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論：微量元素鐵鋅硒(鐵鋅硒均對機體免疫功能產(chǎn)生影響)與甲型病毒肝炎存在密切關系。實驗組與對照組血清中微量元素之間比值的比較結(jié)果

HAV感染者Cu/Zn、Fe/Zn比值均高于對照組,但只有甲肝患者組與對照組比較差異有顯著性意義(P<0.01)。結(jié)論：

Cu/Zn、Fe/Zn比值與甲型肝炎有密切關系,說明機體內(nèi)的微量元素含量應保持在一定范圍內(nèi),各元素含量之間的相互影響對機體的代謝生理將會產(chǎn)生影響。第五節(jié)

電化學分析法電化學分析法：應用電化學的基本原理和實驗技術，依據(jù)物質(zhì)電化學性質(zhì)（通過測量電池的電位、電流、電導等電化學參數(shù)）測定物質(zhì)組成及含量。按測量的電化學參數(shù)分類:(1)電導分析法：測量電導值；(2)電位分析法：測量電動勢；(3)電解(電重量)分析法：測量電解過程電極上析出物重量；(4)庫侖分析法：測量電解過程中的電量；(5)伏安分析：測量電流與電位變化曲線；(6)極譜分析：使用滴汞電極時的伏安分析電池電動勢：指當流過電池的電流為零或接近零時兩極間的電位差。一、電化學分析法的基礎知識（一）化學電池

化學電池的組成：兩個電極、電解質(zhì)和外電路?；瘜W能與電能的轉(zhuǎn)換裝置；化學電池分成原電池和電解池。原電池：自發(fā)地將化學能轉(zhuǎn)變成電能；電解電池：由外電源提供電能，使電流通過電極，在電極上發(fā)生電極反應的裝置。電池工作時，電流必須在電池內(nèi)部和外部流過，構成回路。溶液中的電流：正、負離子的移動。原電池負極：發(fā)生氧化反應的電極；正極：發(fā)生還原反應的電極；陽極≠正極，陰極≠負極電極電位較正的為正極電解電池陽極：發(fā)生氧化反應的電極；陰極：發(fā)生還原反應的電極；陽極≠正極陰極≠負極電化學分析法的特點（1）靈敏度、準確度高，選擇性好測定最低量：10-12mol/L數(shù)量級。（2）電化學儀器裝置較簡單，操作方便。（3）應用廣泛傳統(tǒng)電化學分析：無機離子的分析；有機電化學分析；生物、藥物分析；活體分析和監(jiān)測（超微電極直接刺入生物體內(nèi)）。（二）電極電位1．標準電極電位2．能斯特(W.H.Nernst)方程對于給定的電極而言，電極電位是一個確定的常量，對于下述電極反應：

aA+bB+ne-

?

cC+dD電極電位的能斯特方程：E=Eθ+RT

nFlnaAa

aBbaCc

aDd氧化還原體系：Ox+ne-=Red能斯特方程：金屬電極：（二）電極的類型1．基于電子交換反應的電極：第一類、第二類、第三類和第零類電極。2．基于離子交換和擴散的電極：離子選擇性電極。

1．基于電子交換反應的電極：

（1）第一類電極──金屬-金屬離子電極例如：Ag-AgNO3電極(銀電極)，25oC時

EAg+/Ag=E

Ag+/Ag+0.059lgaAg+

（2）第二類電極──金屬-金屬難溶鹽電極例如（Ag，AgCl（固）KCl

）電極：銀絲鍍上一層AgCl沉淀，浸在一定濃度的KCl溶液中。25℃時，

EAgCl/Ag=E

AgCl/Ag-0.059lgaCl-（3）第三類電極──Pb，PbC2O4(s)，CaC2O4(s)∣Ca2+

：

25oC時，

E=E

+(0.059/n)?lgaCa2+

（4）第零類電極（惰性金屬電極）電極不參與反應，但其晶格間的自由電子可與溶液進行交換。惰性金屬電極作為氧化態(tài)、還原態(tài)獲得電子或釋放電子的場所。Pt∣Fe3+，F(xiàn)e2+，25oC時，E(Fe3+/Fe2+)=E

(Fe3+/Fe2+)+0.059lg（aFe3+/aFe2+）

離子選擇性電極(又稱膜電極)。

1976年IUPAC基于膜的特征，推薦將其分為以下幾類：原電極（primaryelectrodes）

晶體膜電極（crystallinemembraneelectrodes）

均相膜電極（homogeneousmembraneelectrodes）

非均相膜電極(heterogeneousmembraneelectrodes)

非晶體膜電極（crystallinemembraneelectrodes）

剛性基質(zhì)電極（rigidmatrixelectrodes）

流動載體電極(electrodeswithamobilecarrier)

敏化電極（sensitizedelectrodes）

氣敏電極（gassensingelectrodes）

酶電極（enzymeelectrodes）2．離子選擇性電極的種類、原理與結(jié)構

type,principleandstructureofionselectiveelectrode特點：僅對溶液中特定離子有選擇性響應。膜電極的關鍵：是一個稱為選擇膜的敏感元件。敏感元件：單晶、混晶、液膜、功能膜及生物膜。膜電位：膜內(nèi)外被測離子活度的不同而產(chǎn)生電位差。將膜電極和外參比電極一起插到被測溶液中，則電池結(jié)構為:外參比電極‖被測溶液(ai未知)∣內(nèi)充溶液(ai一定)∣內(nèi)參比電極內(nèi)外參比電極的電位值固定，且內(nèi)充溶液中離子活度一定，則電極電位為：（敏感膜）二、電位分析法通過測量電極電位來測定物質(zhì)含量的分析方法。研制各種高靈敏度、高選擇性的電極是電位分析法最活躍的研究領域之一?；瘜W電池：由參比電極和指示電極組成。ΔE=E

+-E

-

電位分析法按應用方式分為：直接電位法和電位滴定法

電位滴定法:用電位測量裝置指示滴定分析過程中被測組分的濃度變化，通過記錄或繪制滴定曲線來確定滴定終點。直接電位法:電極電位與溶液中電活性物質(zhì)的活度有關，通過測量溶液的電動勢，根據(jù)能斯特方程計算被測物質(zhì)的含量；

（一）參比電極甘汞電極：Hg，Hg2Cl2（固）KCl電極反應：Hg2Cl2+2e-

=2Hg+2Cl-表

甘汞電極的電極電位（25℃）溫度校正，對于飽和甘汞電極（SCE），t

℃時的電極電位為：Et=0.243-7.6×10-4(t-25)（V）=E

(Hg2Cl2/Hg)-0.059lgaCl-E(Hg2Cl2/Hg)=E

(Hg2Cl2/Hg)+0.0592lg

1

aCl-2標準Ag-AgCl電極溫度校正，t

℃時的電極電位為：Et=0.2223-6×10-4(t-25)（V）銀-氯化銀電極（Ag，AgCl（固）KCl

）：銀絲鍍上一層AgCl沉淀，浸在一定濃度的KCl溶液中。電極反應：AgCl+e-==Ag+Cl-電極電位（25℃）：EAgCl/Ag=E

AgCl/Ag-0.059lgaCl-

表銀-氯化銀電極的電極電位（25℃）敏感膜：(氟化鑭單晶)摻有EuF2

的LaF3單晶切片；內(nèi)參比電極：Ag-AgCl電極(管內(nèi))。內(nèi)參比溶液：0.1mol/L的NaCl和0.1mol/L的NaF混合溶液（F-用來控制膜內(nèi)表面的電位，Cl-用以固定內(nèi)參比電極的電位）。

（二）指示電極

（其電極電位與被測物質(zhì)的濃度相關）1.晶體膜電極（氟電極）原理:

LaF3的晶格中有空穴，在晶格上的F-可以移入晶格鄰近的空穴而導電。對于一定的晶體膜，離子的大小、形狀和電荷決定其是否能夠進入晶體膜內(nèi)，故膜電極一般都具有較高的離子選擇性。當氟電極插入到F-溶液中時，F(xiàn)-在晶體膜表面進行交換。25℃時：E膜

=K-0.059lgaF-

=K+0.059pF

具有較高的選擇性，需要在pH5～7之間使用，pH高時，溶液中的OH-與氟化鑭晶體膜中的F-交換，pH較低時，溶液中的F

-生成HF或HF2

-

。

2．非晶體膜電極（剛性基質(zhì)電極）(1)pH玻璃膜電極：選擇響應氫離子活度屬非晶體膜電極（玻璃膜的組成不同可制成對不同陽離子響應的玻璃電極）

H+響應的玻璃膜電極：敏感膜厚度約為0.05mm。

SiO2基質(zhì)中加入Na2O、Li2O和CaO燒結(jié)而成的特殊玻璃膜。玻璃電極使用前，必須在水溶液中浸泡。水浸泡后，表面的Na+與水中的H+交換，表面形成水合硅膠層。玻璃電極放入待測溶液，生成三層結(jié)構，即中間的干玻璃層和兩邊的水化硅膠層：玻璃膜電位的形成25℃平衡時：E外

=k1+0.059lg(a1/a1’

）

E內(nèi)

=k2+0.059lg(a2/a2’

）a1

、a2：外部試液和電極內(nèi)參比溶液的H+活度a’1

、a’2：玻璃膜外、內(nèi)水合硅膠層表面的H+活度k1

、k2

：由玻璃膜外、內(nèi)表面性質(zhì)決定。玻璃膜內(nèi)、外表面的性質(zhì)基本相同，則k1=k2

，a’1=a’2

E膜

=E外

-E內(nèi)

=0.059lg(a1/a2）a2是固定的，則:

E膜

=K′+0.059lg

a1=K′-0.059pH試液

E玻

=E內(nèi)參比

+K′+0.059lg

a1=K”-0.059pH試液將膜電極和外參比電極一起插到被測溶液中組成電池。電池結(jié)構為:被測液(ai未知)∣內(nèi)充液(ai一定)∣內(nèi)參比電極‖外參比電極（敏感膜）電池電動勢：ΔE=ESCE-E玻=ESCE-（E內(nèi)參比

+K′+0.059lg

aH+

）=E′-0.059lg

a

=E′+0.059pH（SCE）討論

(1)酸差：被測溶液酸度太大（pH<1）時,電位值偏離線性關系，產(chǎn)生誤差;(2)“堿差”或“鈉差”:pH>12產(chǎn)生誤差，主要是Na+參與相界面上的交換所致；(3)改變玻璃膜的組成，可制成對其它陽離子響應的玻璃膜電極；(4)優(yōu)點：不受溶液中氧化劑、還原劑、顏色及沉淀的影響，不易中毒；(5)缺點：電極內(nèi)阻高，電阻隨溫度變化大。

鈣電極：內(nèi)參比溶液為含

Ca2+水溶液。內(nèi)外管之間裝的是0.1mol/L二癸基磷酸鈣(液體離子交換劑)的苯基磷酸二辛酯溶液。其極易擴散進入微孔膜，但不溶于水，故不能進入試液溶液。

二癸基磷酸根可以在液膜-試液兩相界面間傳遞鈣離子，直至達到平衡。由于Ca2+在水相（試液和內(nèi)參比溶液）中的活度與有機相中的活度差異，在兩相之間產(chǎn)生相界電位。液膜兩面發(fā)生的離子交換反應：[(RO)2PO]2-Ca2+(有機相)=2[(RO)2PO]2-(有機相)+Ca2+(水相)

鈣電極適宜的pH范圍是5～11，可測出10-5mol/L的Ca2+。(2)流動載體膜電極（液膜電極）流動載體膜電極（液膜電極）的討論(1)流動載體膜電極（液膜電極）的機理與玻璃膜電極相似；(2)離子載體（有機離子交換劑）被限制在有機相內(nèi)，但可在相內(nèi)自由移動，與試樣中待測離子發(fā)生交換產(chǎn)生膜電位；(3)具有R-S-CH2COO-結(jié)構的液體離子交換劑，由于含有硫和羧基，可與重金屬離子生成五元內(nèi)環(huán)配合物，對Cu2+、Pd2+等具有良好的選擇性；

(4)采用帶有正電荷的有機液體離子交換劑，如鄰菲羅啉與二價鐵所生成的帶正電荷的配合物，可與陰離子ClO4-，NO3-等生成締合物，可制備對陰離子有選擇性的電極；

(5)中性載體(有機大分子)液膜電極，中空結(jié)構，僅與適當離子配合，高選擇性，如頡氨霉素（36個環(huán)的環(huán)狀縮酚酞）對鉀離子有很高選擇性，KK,Na=3.1×10-3；

(6)冠醚化合物也可用作為中性載體。

3.敏化電極敏化電極是指氣敏電極、酶電極、細菌電極及生物電極等。(1)氣敏電極：由離子敏感電極、參比電極，中間電解質(zhì)溶液和憎水性透氣膜組成。結(jié)構特點:在原電極上覆蓋一層膜或物質(zhì)，使得電極的選擇性提高。試樣中待測組分氣體擴散通過透氣膜，進入玻璃敏感膜與透氣膜之間的液層內(nèi)，使液層內(nèi)離子選擇電極敏感的離子活度變化，膜電位改變，電池電動勢發(fā)生變化。氨氣敏電極中介液中：

H2O

+NH3

?

OH-+NH4+氣敏電極一覽表(2)生物電極：將生物化學和電分析化學相結(jié)合而研制成的電極。特點：將電位法電極作為基礎電極，生物酶膜或生物大分子膜作為敏感膜，實現(xiàn)對底物或生物大分子的分析。1）酶電極：是基于界面化學反應的敏化電極。酶特性：酶是具有特殊生物活性的催化劑，對反應的選擇性強，催化效率高，可使反應在常溫、常壓下進行；例如：測定尿液試液中尿素的含量。（1）在氣敏電極表面涂尿素酶（2）在銨離子選擇性電極表面涂尿素酶尿素酶CO(NH2)2+H2O──→2NH3+CO2

氨電極檢測

酶催化反應：尿素酶葡萄糖氧化酶CO(NH2)2+H2O──→2NH3+CO2

氨電極檢測葡萄糖+O2+H2O───→葡萄糖酸+H2O2

氧電極檢測可被現(xiàn)有離子選擇性電極檢測的常見的酶催化產(chǎn)物：CO2，NH3，NH4+，CN-，F(xiàn)-，S2-，I-，NO2-2）電位法免疫電極：可直接檢測免疫反應的發(fā)生。原理：抗體與抗原結(jié)合后的電化學性質(zhì)與單一抗體或抗原的電化學性質(zhì)相比，發(fā)生了較大的變化。將抗體（或抗原）固定在膜或電極的表面，與抗原（或抗體）形成免疫復合物后，膜中電極表面的物理性質(zhì)發(fā)生改變，引起膜電位或電極電位的改變。3）組織電極(tissueelectrodes)：以動植物組織為敏感膜，生物組織內(nèi)豐富存在的酶作為催化劑，利用電位法指示電極對酶促反應產(chǎn)物或反應物的響應，而實現(xiàn)對底物的測量。優(yōu)點：

a.來源豐富，許多組織中含有大量的酶；

b.性質(zhì)穩(wěn)定，組織細胞中的酶處于天然狀態(tài)，可發(fā)揮較佳功效；

c.專屬性強；

d.壽命較長；

e.制作簡便、經(jīng)濟。制作關鍵：生物組織膜的固定，通常采用的方法有物理吸附、共價附著、交聯(lián)、包埋等。組織電極的酶源與測定對象一覽表（三）直接電位法（directpotentiometry）電位分析法有兩種分析方式：直接電位法和電位滴定法。直接電位法：將指示電極和參比電極一起浸入待測溶液中組成原電池，測量電池電動勢，得到指示電極的電極電位，由此計算出待測物質(zhì)的濃度。但直接電位法并不是由電池電動勢計算溶液濃度，而是依靠標準溶液進行測定。

1．溶液pH測量(-)玻璃電極|待測pH溶液||SCE(+)298.15K時，ΔE=ESCE-E玻=ESCE-（E內(nèi)參比

+K′+0.059lg

aH+

）=E′+0.059pH試液(-)玻璃電極|pH已知溶液||SCE(+)ΔEs=E′+0.059pHs(-)玻璃電極|待測pH溶液||SCE(+)ΔEx=E′+0.059pHxpHx=pHs+(ΔEx–ΔEs)0.05916已知值表標準pH溶液

2．溶液離子活度測定離子選擇性電極（指示電極）和參比電極（SCE）插入試液組成測定各種離子活度的電池。若為陽離子選擇性電極，298K時，E玻

=K′+0.05916lg

ai電池電動勢：

ΔE=E玻-ESCE標準曲線法：配制系列待測離子的標準溶液，分別測定各溶液的電位值，繪制E-lgci

關系曲線（線性關系）。Elg

ci分析上常要求測定離子濃度E=K′+0.0592lg

ai

=K′-0.0592lgγicx=K′-0.0592lgγi

-0.0592lg

cx為使試液和標準液中離子強度保持一致，需加入總離子強度調(diào)節(jié)緩沖劑（TISAB

）（TotleIonicStrengthAdjustmentBuffer）。TISAB的作用：①使活度系數(shù)恒定；②維持適宜的pH范圍，滿足離子電極的要求；③掩蔽干擾離子。測F-過程所使用的TISAB典型組成：1mol/L的NaCl:保持較大穩(wěn)定離子強度；0.25mol/LHAc和0.75mol/LNaAc:溶液pH=5；0.001mol/L檸檬酸鈉:掩蔽Fe3+、Al3+干擾離子。離子選擇電極除了對某特定離子有響應外，溶液中共有的離子對待測離子有干擾。若測定離子為i，電荷為zi；干擾離子為j，電荷為zj。考慮到共存離子產(chǎn)生的電位，則膜電位的一般式可寫成為：KiJ（電極的選擇性系數(shù)）意義：在相同的測定條件下，待測離子和干擾離子產(chǎn)生相同電位時待測離子的活度αi與干擾離子活度αj的比值:Kij=αi/αj選擇性系數(shù)（KiJ）表示電極對主要離子的響應與對干擾離子響應的倍數(shù)，該值越小，電極對待測離子的選擇性越好。例如：Kij

=0.001時,意味著干擾離子j

的活度是待測離子

i

的活度1000倍時,兩者產(chǎn)生相同的電位（設Zi=Zj）。例題：用pNa玻璃膜電極（KNa+，K+=0.001）測定pNa=3的試液（pK=2）時，產(chǎn)生的誤差是多少?解:誤差%=(KNa+，K+×aK+)/aNa+×100%=(0.001×10－2)/10－3×100%=1%（四）離子選擇性電極在臨床醫(yī)學和醫(yī)學檢驗中的應用1．細胞外分析離子選擇性電極在腦髓液、大腦表面、體液、胃液的原位測定。探針型pH玻璃電極測定單個近球小管的官腔液體中的pH，研究腎對H+的調(diào)節(jié)作用。探針型pH玻璃電極刺入貓腦中，監(jiān)測在不同新陳代謝條件下腦中pH變化。2．細胞內(nèi)分析離子選擇性電極測定細胞內(nèi)離子活度及活度變化，為細胞生理學提供資料。用鉀、鈉離子選擇性電極測定動物骨骼肌肉細胞內(nèi)鉀、鈉離子活度，研究鉀、鈉離子在細胞內(nèi)被有機高分子電解質(zhì)束縛情況，發(fā)現(xiàn)兩棲動物骨骼肌肉細胞內(nèi)70%鈉離子被束縛，鉀離子基本游離。研究氟對大鼠肝臟氧化應激及超微結(jié)構的影響

慢性氟中毒是一種全身性疾病,過量的氟進入機體除了累及牙齒和骨組織之外,對非骨相組織和器官亦能產(chǎn)生損害。肝臟是氟中毒引起的非骨相損害的重要器官之一，實驗表明氟中毒可引起肝臟組織結(jié)構和功能異常。通過檢測氟中毒大鼠肝臟內(nèi)氧化應激情況為深入研究氟中毒肝臟病變提供科學依據(jù)。實驗:在飲水中加入不同劑量的氟化鈉(0,50，100，150mg/L)喂飼大鼠3個月。測定：尿氟、血氟濃度肝臟丙二醛(MDA)含量超氧化物歧化酶(SOD)活性谷胱甘肽過氧化物酶(GSH2Px)活性測定方法:

尿氟、血氟濃度:采用氟離子選擇電極法。丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量:采用硫代巴比妥酸熒光法;超氧化物歧化酶(superoxide

dismutase,SOD)活性:采用亞硝酸鹽法;谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH2Px)活性:用二硫代雙硝基苯甲酸直接法。結(jié)果（與對照組比較）：染氟組大鼠肝臟MDA含量升高；SOD、GSH2Px活性下降。結(jié)論：過量氟使大鼠肝臟處于氧化應激狀態(tài),損傷細胞膜性結(jié)構和DNA,造成肝臟損傷。離子選擇性電極法測定牙膏中氟含量

氟化鈉、單氟磷酸鈉等氟化物作為防齲劑添加在牙膏中，在刷牙的過程中以游離狀態(tài)存在的氟離子與牙齒表面的羥基磷灰石有較大的親和力。當牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)的羥基磷灰石吸收了氟之后，增強了牙齒耐酸腐蝕的能力，加快磷和鈣的沉積速度，促進齲損表面的再礦化。目前國內(nèi)有20多種品牌的牙膏都添加氟化物。由于氟本身也是一種毒性物質(zhì)，過量攝人可能會引起氟斑牙、氟骨癥等，因此含氟藥物牙膏中，氟化物含量的測定顯得非常重要。方法：采用氟離子選擇電極測定市售含氟牙膏(9種)中總氟的含量

氟標準儲備液配置：NaF烘干2h，用去離子水溶解后定量轉(zhuǎn)移到1000mL容量瓶中，搖勻備用。

總離子強度緩沖劑（TISAB）：去離子水，冰醋酸，NaC1，檸檬酸，6mol／LNaOH溶液，調(diào)節(jié)pH=5．5-6．5之間。結(jié)果與討論1.標準曲線的繪制一組氟離子標準溶液濃度（mol／L）10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，電極：氟電極和飽和甘汞電極，讀取并記錄電池電動勢。利用origin5軟件繪作E—pF圖。電動勢E與pF關系的回歸方程：E=8.48—52.06pF，(相關系數(shù)r=0．99901)，氟離子濃度在10-2--10-6mol／L范圍內(nèi)，E與pF之間具有良好的線形關系。2.牙膏中氟含量的測定配制1#，2#，3#，鐘，5#，6#，7#，8#，9#牙膏被測液，在與標準曲線相同的條件下測定電動勢E值。1#一9#牙膏中含氟量均達到國家標準要求（五）電位分析法在醫(yī)學檢驗中應用主要應用：（1）血液、血清、血漿、唾液、尿液、腦脊液等生物試樣中Ca2+、K+、Na+、Cl-、F-等離子濃度的測定。（2）測定血液與其它體液中氨基酸、葡萄糖、尿酸、乳酸、肌酸、尿素、白蛋白、血脂、肌酸酐、膽固醇等，為疾病的臨床診斷、輔助診斷和預防提供依據(jù)。血清中游離鈣濃度的測定鈣是生物體內(nèi)調(diào)節(jié)平衡的重要生理活性物質(zhì)，血液和體液中鈣離子濃度對臨床的診斷和治療十分重要。鈣在血清中游離鈣、蛋白結(jié)合鈣和復合鈣存在。具實際生物意義的鈣主要是游離鈣，其含量約為血總鈣的50％。血清鈣游離鈣（生物活性物質(zhì)）結(jié)合鈣血游離鈣值的上升和下降較總鈣值的變化更為敏感和顯著，測定血游離鈣能夠準確地反映機體鈣的代謝，研究甲狀腺機能亢進、慢性腎炎、尿毒疹、多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機制及臨床診斷?？梢詾槲覀冞x擇經(jīng)濟、效佳的補鈣制劑提供幫助；生物體內(nèi)鈣離子的研究成為生理、生化、病理、藥學及臨床等學科感興趣的課題。血清中游離鈣濃度的測定（1）校準曲線繪制：取Ca2+標準液1.00，2.50，5.00，10.00，15.00mL，加入Tris緩沖液（三羥甲基氫基甲烷，pH=4.2），離子強度調(diào)節(jié)劑（NaCl，KCl，MgCl2），插入鈣離子選擇性電極，飽和甘汞電極。測定電動勢，作E–logc曲線。（2）血清中游離鈣濃度的測定取血清樣品，加入上述應用液稀釋，測定被測液電池電動勢，得Ex。（3）在校準曲線上查出cx

。三、電位滴定分析法1.電位滴定裝置與滴定曲線每滴加一次滴定劑，平衡后測量電動勢。記錄每次滴定時的滴定劑用量（V）和相應電動勢數(shù)值（Δ

E），作圖得滴定曲線。關鍵:確定滴定反應的化學計量點時,所消耗的滴定劑的體積。突躍范圍內(nèi)每次滴加體積控制在0.1mL。通常采用三種方法來確定電位滴定終點。(1)E–V曲線法：圖（a）

簡單，準確性稍差。(2)ΔE/ΔV–V曲線法：圖（b）

一階微商由電位改變量與滴定劑體積增量之比計算之。曲線上存在著極值點，該點對應著E-V曲線中的拐點。(3)Δ2E/ΔV2–V曲線法：圖（c）

Δ2E/ΔV2二階微商。2.電位滴定終點確定方法ΔEΔVΔ()ΔV3.電位分析法的應用與計算示例例題：以銀電極為指示電極,雙液接飽和甘汞電極為參比電極,用0.1000mol/LAgNO3標準溶液滴定含Cl-1試液,得到的原始數(shù)據(jù)如下(電位突越時的部分數(shù)據(jù))。用二級微商法求出滴定終點時消耗的AgNO3標準溶液體積?解:將原始數(shù)據(jù)按二級微商法處理，一級微商和二級微商由后項減前項比體積差得到,例:二級微商等于零時所對應的體積值應在24.30～24.40mL之間，準確值可以由內(nèi)插法計算出:電流型生物傳感器的研究進展二十世紀六十年代：生物傳感器產(chǎn)生。二十世紀八十年代初開始：微電子學和微型計算機以及生物工程的發(fā)展，人們對生物傳感器的興趣顯著增長。相關的出版物和專利也大大增加。在日本，有五個政府部門和五十多個公司致力于生物傳感器的研制工作。在歐洲，有四個國家經(jīng)“尤里卡計劃”批準共同努力進行生物傳感器方面的研究。二十世紀八十年代后，我國有關生物傳感器的研究也開始飛速發(fā)展。生物傳感器的結(jié)構組成：固定化的生物活性物質(zhì)（分子識別部分或稱為感受器）和換能器（信號轉(zhuǎn)換部分，稱為基礎電極或內(nèi)敏感器）。分子識別：廣義上，受體分子與配體（被測物）之間的選擇性結(jié)合就是分子識別。在復雜的混合物中，一個分子或分子片段特異性地識別另一個分子或分子片段，并通過非共價健相互結(jié)合形成一種復合物或超分子的過程。分子識別是生物傳感器工作的理論基礎。

分子識別系統(tǒng)：1）生物體所固有的分子識別系統(tǒng)：酶、受體、抗體／抗原、DNA(RNA)、膜組成物、細胞器、微生物、全生物組織等。具有專一識別各種被測定物的功能，并能與之發(fā)生反應。2）人工分子識別系統(tǒng)（冠醚、環(huán)糊精等）分子之間進行識別后將產(chǎn)生分子本身能態(tài)的變化或分子構象的變化，從而使電位、電流、電荷和電導等參數(shù)發(fā)生變化，導致電信號產(chǎn)生。換能器的作用：將生物化學信號轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢暂敵霾⒓右猿绦蚧康碾娦盘?、光信號等。信號轉(zhuǎn)換方式：場效應晶體管、光電轉(zhuǎn)換器、用于電位或電流測定的電極、熱敏電阻、壓電晶片。生物傳感器優(yōu)點：使用方便、檢測快速、選擇性好、靈敏度高。應用：環(huán)境監(jiān)測與控制、食品加工、生物過程、農(nóng)業(yè)、藥物和石油化工。電流型生物傳感器（生物選擇性電極）伏安分析法中的一種，在一定的電位下測量體系電流。其中研究最為廣泛的是葡萄糖生物傳感器。1、電流型葡萄糖生物傳感器人體的血糖水平是臨床檢測的一個重要指標，尤其是對于糖尿病人而言。1962年，Clark和Lyons提出葡萄糖生物傳感器的原理：用一薄層葡萄糖氧化酶（GOD）覆蓋在氧電極表面，通過氧電極檢測溶液中溶解氧的消耗量可以間接測定葡萄糖的含量。1967年，成功制成第一支葡萄糖生物傳感器。電流型葡萄糖生物傳感器對葡萄糖響應的機理：O2在葡萄糖氧化酶催化下氧化葡萄糖，生成H2O2反應方程式：GOD(FAD)+葡萄糖→G0D(FADH2)+葡萄糖酸內(nèi)脂GOD(FADH2)+O2→GOD(FAD)+H2O2總反應式：

葡萄糖+O2

葡萄糖酸內(nèi)脂+H2O2GODGOD(FAD)：葡萄糖氧化酶的氧化態(tài)，GOD(FADH2)：葡萄糖氧化酶的還原態(tài)。

由于葡萄糖還原氧化態(tài)的葡萄糖氧化酶GOD(FAD)后，產(chǎn)生的還原態(tài)葡萄糖氧化酶的氧化還原活性中心(FADH2)在酶分子內(nèi)部，受蛋白質(zhì)的包圍，不易直接與常規(guī)電極交換電子，因而也得不到可測量的電信號。采用兩種方法：1）測量反應物O2的減少量2）測量反應產(chǎn)物H2O2的產(chǎn)生量1）測量反應物O2的減少量用氧電極測量溶液中溶解氧的變化，間接地測出試樣中葡萄塘的含量。但是，該方法中由于大氣中氧氣分壓的變化會導致溶液中溶解氧濃度的變化，從而影響測定的準確性。2）測量反應產(chǎn)物H2O2的產(chǎn)生量采用兩個金屬鉑(Pt)電極做工作電極：一個電極表面為酶膜所覆蓋，通過差示電流，扣除空白并消除干擾后可以較準確地測定H2O2的產(chǎn)生量，從而間接測定葡萄糖的含量。通過普魯士藍修飾玻碳電極測定H2O2的葡萄糖生物傳感器：電極對H2O2有較好的電催化作用，可以在0.18V對H2O2進行還原測定或在0.85V對H2O2進行氧化測定，從而間接測定葡萄糖的含量。特點：檢測靈敏度高。許多基于同一原理的其它電流型生物傳感器相繼報道，所涉及到的氧化酶有：乙酰膽堿和膽堿氧化酶、膽固醇氧化酶、尿素酶、乳酸氧化酶和黃嘌呤氧化酶等。局限性：用常規(guī)電極氧化H2O2時電位較高：在鉑電極上(0．5～0．7V）、在玻碳電極上(0.9V)。

在高電位下進行氧化測定，試樣中共存的其它電活性物質(zhì)（抗壞血酸(維生素C)和尿酸）也能被氧化而產(chǎn)生氧化電流，給測定帶來干擾，因此該方法的靈敏度和選擇性相對較差。雙酶電極：把過氧化物酶(如辣根過氧化物酶、細胞色素過氧化物酶等)與葡萄糖氧化酶結(jié)合制成，通過過氧化物酶對H2O2生物電催化還原進行測定，間接測定葡萄糖的含量，在較低電位下進行(-0.25—0.00V)，避免其它電活性物質(zhì)的干擾，提高了生物傳感器的靈敏度和選擇性。b-D-葡萄糖濃度的測定：方法1：葡萄糖傳感器中的基礎電極：酶Pt/H2O2電極和酶Pt/O2電極。鉑柱電極為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，Ag-AgCl電極為參比電極。通過測量Pt/H2O2電極上的反應電流可確定底物b-D-葡萄糖的濃度。方法2：將葡萄糖氧化酶固定到pH傳感器表面可制成葡萄糖傳感器。傳感器上的氧化酶首先和葡萄糖作用生成葡萄糖酸(一種弱酸)，然后利用pH傳感器對H+的敏感，測定電位的相應變化，即可算出葡萄糖的含量。第六節(jié)色譜法一、色譜法概述

色譜法是一種物理化學分析方法。利用不同溶質(zhì)（樣品）與固定相和流動相之間的作用力（分配、吸附、離子交換等）的差別）分離混合物。固定相（在色譜分離中固定不動、對樣品產(chǎn)生保留的一相）流動相（與固定相處于平衡狀態(tài)、帶動樣品向前移動的另一相）色譜分離與適當?shù)闹髾z測方法結(jié)合，實現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測，已成為所有復雜混合物分離鑒定的必不可少的分離分析方法。俄國植物學家茨維特在1906年使用的色譜原型裝置二、色譜法的分類(1)氣相色譜：流動相為氣體（稱為載氣）(2)液相色譜：流動相為液體（淋洗液）離子交換色譜：以特制的離子交換樹脂為固定相，水溶液為流動相。高效毛細管電泳:九十年代快速發(fā)展、特別適合生物試樣分析分離的高效分析儀器。試樣由載氣帶進色譜柱，被固定相溶解或吸附;載氣的不斷通入，被溶解或吸附組分又從固定相中揮發(fā)或脫附;揮發(fā)或脫附下的組分隨載氣向前移動時又再次被固定相溶解或吸附;隨著載氣的流動，溶解、揮發(fā)，或吸附、脫附反復進行。三、色譜分離過程和色譜圖（一）氣相色譜分離過程基線：無試樣通過時，檢測到的信號。色譜峰：溶質(zhì)開始流出至完全流出所對應的峰型部分。（二）色譜圖1．基線、色譜峰：從色譜柱流出的溶液（柱流出物）進入檢測器連續(xù)測定，得到柱流出物中溶質(zhì)濃度隨時間變化的曲線，（1）時間表示的保留值保留時間（tR）：組分從進樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值所需的時間；死時間（tM）：不與固定相作用的氣體（如空氣）的保留時間；調(diào)整保留時間（tR

＇）：tR＇=

tR－tM

2．保留值：表示試樣中各組分在色譜柱中停留的時間或?qū)⒔M分帶出色譜柱所需流動相體積的數(shù)值。

（2）用體積表示的保留值保留體積（VR）：死體積（VM）：

調(diào)整保留體積(VR＇)：

V

R＇=VR

－VM

3.相對保留值r21

組分2與組分1調(diào)整保留值之比：r21=t′R2

/t′R1=V′R2/V′R1相對保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關，與其他色譜操作條件無關，它表示固定相對這兩種組分的選擇性。4．分配系數(shù)（partionfactor）K和容量因子分配系數(shù)：組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的濃度（單位：g/mL）比。分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)（三）分離度：塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質(zhì)對的實際分離程度。即柱效為多大時，相鄰兩組份能夠被完全分離。分離度受色譜過程中兩種因素的綜合影響：保留值之差──色譜過程的熱力學因素；區(qū)域?qū)挾醛ぉどV過程的動力學因素。分離度的表達式：R=0.8：兩峰的分離程度可達89%；R=1：分離程度98%；R=1.5：達99.7%（相鄰兩峰完全分離的標準）tR(1)和tR(2)分別為峰1和峰2的保留時間；wb(1)和wb(2)分別為峰1和峰2在峰底（基線）的峰寬。R=2(tR(2)

–tR(1))Wb(2)

+Wb(1)

第七節(jié)氣相色譜法一、氣相色譜法概述氣相色譜是以氣體為流動相的一種色譜法。它具有高選擇性、高效能、高靈敏度、分析速度快、應用范圍廣等特點。二、氣相色譜儀器

gaschromatographicinstruments1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；3-凈化干燥管；4-針形閥；5-流量計;6-壓力表；4-針形閥；5-流量計；6-壓力表；9-熱導檢測器；10-放大器；11-溫度控制器；12-記錄儀；載氣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)色譜柱檢測系統(tǒng)溫控系統(tǒng)（一）氣相色譜法的一般流程processofgaschromatograph常用載氣：氫氣、氮氣、氦氣；凈化干燥管：去除載氣中的水、有機物等雜質(zhì)（依次通過分子篩、活性炭等）；載氣流速控制：壓力表、流量計、針形穩(wěn)壓閥，控制載氣流速恒定。（二）氣相色譜儀的結(jié)構氣路系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、檢測器、溫度控制系統(tǒng)和放大與記錄系統(tǒng)1.氣路系統(tǒng)2、分離系統(tǒng)（色譜柱）色譜柱：色譜儀的核心部件。

1)固體固定相：常用固體吸附劑（活性炭、氧化鋁、硅膠等）2)液體固定相包括固定液和載體兩部分：a、固定液：涂漬在惰性多孔固體基質(zhì)（載體或擔體）上的液體物質(zhì)。b、載體：固定液的支持物，分無機載體和有機載體。液體進樣器3.進樣裝置：進樣器+氣化室；氣化室：將液體試樣瞬間氣化的裝置。無催化作用。4.檢測系統(tǒng)被色譜柱分離后的組分依次進入檢測器，按其濃度或質(zhì)量隨時間的變化，轉(zhuǎn)化成相應電信號，經(jīng)放大后記錄和顯示，給出色譜圖；

5.溫度控制系統(tǒng)氣化室：保證液體試樣瞬間氣化；檢測器：保證被分離后組分通過時不在此冷凝；分離室：準確控制分離需要的溫度。三、色譜定性與定量分析方法（一）色譜定性分析1.保留值定性（1）利用保留時間定性：在一定的色譜系統(tǒng)和操作條件下，每種物質(zhì)都有一定的保留時間，如果在相同色譜條件下，未知物的保留時間與標準物質(zhì)相同，則可初步認為它們?yōu)橥晃镔|(zhì)。（2）利用加入法定性：將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分色譜峰的相對變化。2.利用相對保留值r21定性：相對保留值r21僅與柱溫和固定液性質(zhì)有關。在色譜手冊中都列有各種物質(zhì)在不同固定液上的保留數(shù)據(jù)，可以用來進行定性鑒定。3.與其他儀器聯(lián)用定性：將具有定性能力的分析儀器如質(zhì)譜（MS）、紅外（IR）、原子吸收光譜（AAS）、原子發(fā)射光譜（AES，ICP-AES）等作為色譜儀的檢測器。小型化的臺式色質(zhì)譜聯(lián)用儀GC-MSLC-MS試樣中各組分質(zhì)量與其色譜峰面積成正比：

mi=

fi·Ai絕對校正因子（f

i

）與檢測器響應值的關系：

f

i=1/Si

相對校正因子f

’i

：即組分的絕對校正因子與標準物質(zhì)的絕對校正因子之比。1．校正因子定量（二）色譜定量分析通常采用峰面積進行定量分析。2．歸一化法色譜定量分析將所有組分的峰面積分別乘以它們的相對校正因子后求和，被測組分X的含量可用下式求得：Axfx’∑Aifi’ni=