核酸等溫擴增

核酸等溫擴增技術(shù)在病毒檢測中的應用1編輯ppt核酸等溫擴增技術(shù)2編輯ppt核酸等溫擴增的優(yōu)勢3編輯ppt核酸等溫擴增的種類4編輯ppt環(huán)介導核酸等溫擴增技術(shù)〔LAMP〕5編輯pptLAMP引物設計原那么6編輯pptLAMP擴增引物設計7編輯pptLAMP擴增過程8編輯ppt9編輯ppt環(huán)引物在莖環(huán)結(jié)構(gòu)環(huán)狀結(jié)構(gòu)處識別并不斷延伸，使雙鏈過早翻開，有利于復雜莖環(huán)結(jié)構(gòu)的成環(huán)和外引物置換作用。這一定程度上加速了整個LAMP擴增循環(huán)階段的反響。10編輯pptLAMP的操作過程11編輯ppt檢測方法12編輯pptLAMP技術(shù)在病原體檢測中的應用13編輯ppt14編輯pptLAMP技術(shù)小結(jié)15編輯pptLAMP技術(shù)的優(yōu)點16編輯ppt存在缺陷所識別的靶位序列長度不得過大，一般在300bp以內(nèi)。因此，無法進行長片段DNA的擴增；LAMP技術(shù)具備高靈敏度，對操作要求嚴格分區(qū)，否那么極易受到污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果；LAMP的反響結(jié)果只有兩種即擴增與不擴增，故在產(chǎn)生非特異性擴增時是難以進行后續(xù)鑒定的；產(chǎn)物相當復雜，無法進行后續(xù)的回收、鑒定、克隆等基因工程操作。17編輯ppt18編輯ppt19編輯ppt20編輯ppt21編輯ppt22編輯pptNASBA的優(yōu)缺點NASBA是種RNA擴增法，因此其主要應用是對RNA病毒的檢測。整個反響能在42℃條件下進行，經(jīng)過兩個小時的擴增可將模板RNA放大至109~1010倍。靈敏度高、特異性強、保真度高。反響成分復雜、需要三種酶導致本錢偏高、須重復參加逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA聚合酶。23編輯ppt滾環(huán)放大(rolling

circleamplification,RCA)技術(shù)基于滾環(huán)只有在單鏈閉合狀態(tài)并有相應引物存在下才能同溫滾動復制的原理。基于連接酶連接、引物延伸與鏈置換擴增反響的一種等溫核酸擴增方法。在恒溫的條件下,可以產(chǎn)生大量的與環(huán)型探針互補的重復序列。RCA反響體系組成：噬菌體φ29DNA聚合酶、單鏈環(huán)狀DNA模板和引物〔一條或一對也可多條〕。噬菌體φ29DNA聚合酶具備很強的鏈置換活性，無需模板別離，酶性穩(wěn)定，可連續(xù)數(shù)小時高效催化合成DNA。24編輯pptRCA的擴增原理25編輯pptSAT技術(shù)實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)〔SimultaneousAmplificationandTesting，簡稱SAT〕是將新一代的核酸恒溫擴增技術(shù)和實時熒光檢測技術(shù)相結(jié)合的一種新型核酸檢測技術(shù)。該技術(shù)具有高靈敏度、高特異性、低污染、反響穩(wěn)定等優(yōu)點。同一溫度下，首先通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生靶標核酸〔RNA〕的一個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個〔100～1000個〕RNA拷貝；每一個RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進入下一個擴增循環(huán)；同時，帶有熒光標記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，實時反映擴增循環(huán)情況。26編輯pptSAT技術(shù)的原理SAT技術(shù)〔SimultaneousAmplificationandTesting〕是基于TMA〔Transcriptionmediatedamplification〕恒溫擴增技術(shù)開展起來的一項最新核酸檢測技術(shù)，是國內(nèi)企業(yè)自主研發(fā)的專利技術(shù)27編輯pptSAT技術(shù)的優(yōu)勢針對靶標核酸特異設計的引物和分子信標，實現(xiàn)特異性的擴增和檢測，有效防止假陰性結(jié)果。

SAT檢測的靶標核酸是RNA，而RNA在病原體外的環(huán)境中易降解，檢測結(jié)果可作為區(qū)分死菌、活菌的依據(jù)，因此更利于用藥之后療效的監(jiān)測和判愈。

SAT技術(shù)的高靈敏度、高特異性那么可以最大程度地確保檢測結(jié)果的高度準確，高度可靠，有效防止假陽性、假陰性結(jié)果。28編輯pptIMSA擴增29編輯pptIMSA擴增的原理30編輯pptIMSA擴增的原理31編輯ppt32編輯ppt33編輯ppt34編輯pptIMSA擴增的優(yōu)點IMSA不僅擁有LAMP檢測技術(shù)類似的應用優(yōu)點，在引物設計和擴增原理上還具有其獨有的特點，使得其具備比LAMP更高檢測靈敏度的潛力。該技術(shù)一定程度上能打破日本LAMP專利在我國的應用限制，使其更好地效勞于我國的傳染病防控、食品平安檢測和環(huán)境物種保護等各個領域。35編輯pptRPA技術(shù)36編輯pptRPA〔recombinasepolymeraseamplification〕技術(shù)，2006年由劍橋大學的OlafPiepenburg等人建立。該技術(shù)利用一種重組酶使單鏈引物與雙鏈DNA模板中互補片段結(jié)合，啟動DNA復制；不需要DNA解鏈過程。其具有便攜，免去PCR儀等大型實驗室設備的使用；快速，20分鐘內(nèi)得到檢測結(jié)果；靈敏度高，幾個拷貝即可檢出；便于保藏，采用凍干粉末狀酶等優(yōu)點。近年來，各國學者陸續(xù)利用RPA技術(shù)，對于DNA病毒、細菌等進行核酸檢測。RPA技術(shù)簡介37編輯pptRPA的原理38編輯ppttetrahydrofuranabasic–sitemimic(THF)四氫呋喃非堿基位點類似物39編輯ppt40編輯pptBasicRPAexoRPA