質(zhì)粒DNA的小量快速提取課件

實驗三十質(zhì)粒DNA的小量快速提?。▔A裂解法）質(zhì)粒DNA的小量快速提取CONTENTS實驗?zāi)康?2實驗原理03實驗背景01實驗試劑04實驗步驟05質(zhì)粒DNA的小量快速提取1.實驗背景質(zhì)粒是染色體外的DNA分子，大小可為1kb到200kb。大多數(shù)來自細(xì)菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子。其復(fù)制和遺傳獨立于細(xì)菌染色體，但復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。質(zhì)粒DNA的小量快速提取1.實驗背景

質(zhì)粒的類型1.嚴(yán)謹(jǐn)型：只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個細(xì)胞內(nèi)只有1~2個質(zhì)粒。2.松弛型：質(zhì)粒在整個周期中隨時可以復(fù)制，當(dāng)染色體復(fù)制停止后，質(zhì)粒依然能復(fù)制，每個細(xì)胞中含有10~200個拷貝。質(zhì)粒DNA的小量快速提取1.實驗背景質(zhì)粒的應(yīng)用大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。嚴(yán)緊型質(zhì)粒用來表達(dá)一些可使宿主細(xì)胞受毒害致死的基因。質(zhì)粒的特點使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價值。質(zhì)粒DNA的小量快速提取2.實驗?zāi)康恼莆諌A裂解法提取質(zhì)粒的原理、步驟及各個主要試劑的作用。質(zhì)粒DNA的小量快速提取3.實驗原理細(xì)菌SDS堿性環(huán)境變性染色體DNA變性質(zhì)粒DNA蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物不能復(fù)性且形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)復(fù)性并溶解在溶液中蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物取上清液后乙醇沉淀質(zhì)粒DNA和大分子RNA沉淀下來，用酚/氯仿除去殘留蛋白質(zhì)離心酸性醋酸鉀質(zhì)粒DNA的小量快速提取4.實驗試劑1.溶液Ⅰ：

50mm/L葡萄糖25mm/LTris·HCl（pH8.0）10mm/LEDTA溶液1的作用：分散細(xì)胞，蟄合金屬離子使金屬酶失活。2.溶液Ⅱ：（新鮮配制）0.2mol/LNaOH,1%SDS溶液2的作用：使細(xì)胞壁在堿性條件下破裂，核酸和蛋白質(zhì)變性。3.溶液Ⅲ：

5mmol/LKAC10ml,冰醋酸11.5ml,水28.5ml溶液3的作用：使PH值恢復(fù)至中性，質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體DNA與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物沉淀。4.酚—氯仿：作用:使蛋白質(zhì)變性，進(jìn)一步除去少量殘留的蛋白質(zhì)5.無水乙醇：作用:除去DNA水化層，使DNA沉淀6.70%乙醇：作用：洗去質(zhì)粒DNA沉淀中含的少量鹽7.RNaseA:核糖核酸酶A作用：降解DNA污染物（RNA）8.TE緩沖液，LB液體培養(yǎng)基質(zhì)粒DNA的小量快速提取4.實驗儀器高壓滅菌器恒溫?fù)u床高速離心機微量可調(diào)式移液器1.5m離心管質(zhì)粒DNA的小量快速提取5.實驗操作1.細(xì)菌培養(yǎng)2.收集菌體3.懸浮細(xì)菌4.堿性裂解5.中和與復(fù)性6.離心沉淀7.酚/氯仿抽提除蛋白8.乙醇沉淀質(zhì)粒DNA9.乙醇洗鹽10.溶解質(zhì)粒DNA注意：加入溶液1后，一定要徹底懸浮細(xì)菌沉淀，否則所提質(zhì)粒DNA的純度及得率會大大降低。注意：此步需輕柔混合，不要劇烈震蕩，以免打亂基因組DNA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組片段。此時菌液應(yīng)變得清涼粘稠，所用時間不應(yīng)超過5min，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。注意：溶液3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌的收集和裂解質(zhì)粒DNA的分離和純化詳細(xì)步驟：P206質(zhì)粒DNA的小量快速提取5.實驗步驟DNA的保存1.短期貯存：

4℃或-20℃存放與TE緩沖液中。TE緩沖液的PH與DNA儲存有關(guān)，PH為8時，可減少DNA脫氨反應(yīng)，PH低于7.0時DNA容易變性。2.長期貯存：置于TE