細胞培養(yǎng)詳細過程及注意事項

細胞培養(yǎng)具體過程及注意事項

細胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細胞在體外模擬體內(nèi)環(huán)境下，使其生長繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功效的一種培養(yǎng)技術(shù)。細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物能夠是單個細胞，也能夠是細胞群。

細胞培養(yǎng)目的與用途

1、科學研究：藥品研究開發(fā)與基礎(chǔ)研究藥品研究與開發(fā)

(1)新藥篩選：如化學合成藥品藥效研究、中藥有效成分篩選與鑒定等。

(2)疫苗研究與開發(fā)：如病毒性疫苗的研究與開發(fā)（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、腫瘤疫苗(多肽疫苗)等。

(3)基因工程藥品研究與開發(fā)：如干擾素研究與開發(fā)，細胞生長因子研究與開發(fā)等。

(4)細胞工程藥品研究與開發(fā)：生物活性多肽研究與開發(fā)，人參皂甙、紫杉醇等生物活性成分研究與開發(fā)。

(5)單克隆抗體制備：涉及診療用單克隆抗體，治療用單克隆抗體。

基礎(chǔ)研究

(1)藥品作用機理

(2)基因功效

(3)疾病發(fā)生機理

2、生物制藥

(1)疫苗生產(chǎn)：如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、腫瘤疫苗(多肽疫苗)等。

(2)基因工程藥品生產(chǎn)：如在臨床醫(yī)學中含有治療價值的某些細胞生長因子如干擾素、粒細胞生長因子、胸腺肽等

(3)診療用和藥用單克隆抗體生產(chǎn)

(4)細胞工程藥品生產(chǎn)：生物細胞內(nèi)的某些生物活性多肽，生物活性物質(zhì)等

細胞培養(yǎng)基本條件

1、適宜的細胞培養(yǎng)基

適宜的細胞培養(yǎng)基是體外細胞生長增殖的最重要的條件之一，培養(yǎng)基不僅提供細胞營養(yǎng)和促使細胞生長增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，并且還提供培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。

2、優(yōu)質(zhì)血清

現(xiàn)在，大多數(shù)合成培養(yǎng)基都需要添加血清。血清是細胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一，含有細胞生長所需的多個生長因子及其它營養(yǎng)成分。

3、無菌無毒細胞培養(yǎng)環(huán)境

無菌無毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是確保細胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件。在體外培養(yǎng)的細胞由于缺少對微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染，或者本身代謝物質(zhì)積累，可造成細胞中毒死亡。因此，在體外培養(yǎng)細胞時，必須保持細胞生存環(huán)境無菌無毒，及時去除細胞代謝產(chǎn)物。

4、恒定的細胞生長溫度

維持培養(yǎng)細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。

5、適宜的氣體環(huán)境

氣體是哺乳動物細胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體重要有氧氣和二氧化碳。

細胞培養(yǎng)基種類與基本成分

細胞培養(yǎng)基的種類諸多，按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基（現(xiàn)在使用的培養(yǎng)基絕大部分是合成培養(yǎng)基），按其物質(zhì)狀態(tài)分為干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類。干粉培養(yǎng)基需由實驗者自己配制并滅菌，液體培養(yǎng)基由專業(yè)商家提供，顧客可直接使用，非常方便。每種細胞都有其適宜的培養(yǎng)基，詳見附表1。

1、合成培養(yǎng)基的重要成分有：氨基酸、碳水化合物、無機鹽、維生素及其它輔助物質(zhì)

氨基酸

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類的細胞對氨基酸的規(guī)定各異，但有幾個氨基酸細胞本身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾個氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡。

因此，多個培養(yǎng)液中都有較大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲存2周以上時，還應重新加入原來量的谷氨酰胺。碳水化合物

碳水化合物是細胞生長重要能量來源，其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。重要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。

無機鹽

培養(yǎng)液中無機鹽的重要功效是協(xié)助細胞維持滲入壓平衡。另外，通過提供鈉，鉀和鈣離子，協(xié)助細胞調(diào)節(jié)細胞膜功效。培養(yǎng)液的滲入壓是一種非常重要的因素,細胞普通可耐受260mOsm/kg?320mOsm/kg。原則培養(yǎng)液的滲入壓在此范疇內(nèi)波動。特別注意：向培養(yǎng)液中加入其它物質(zhì)有可能會明顯變化培養(yǎng)液的滲入壓，特別是溶于強酸或強堿中的物質(zhì)。向培養(yǎng)液中添加HEPES時需按下列辦法調(diào)節(jié)鈉離子濃度。

緩沖系統(tǒng)

大多數(shù)細胞所需pH在7.2-7.4。但是，細胞培養(yǎng)最適pH值隨培養(yǎng)的細胞種類不同而不同。成纖維細胞喜歡較高pH(7.4-7.7),而傳代轉(zhuǎn)化細胞系則需要偏酸pH(7.0-7.4)。由于多數(shù)培養(yǎng)液靠碳酸氫鈉（NaHCO3）與CO2體系進行緩沖，因此，氣相中的CO2濃度應與培養(yǎng)液中碳酸氫鈉濃度相平衡。如果氣相或培養(yǎng)箱空氣中CO2濃度設(shè)定在5％，培養(yǎng)液中NaHCO3的加入量為1.97g/L；如果CO2濃度維持在10％，培養(yǎng)液中NaHCO3的加入量為3.95g/L。細胞培養(yǎng)瓶蓋不應擰得太緊，以確保氣體交換。

HEPES是一種非離子緩沖液，在pH7.2-7.4范疇內(nèi)含有較好的緩沖能力，但是非常昂貴，在高濃度時對某些細胞可能有毒。HEPES緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34g/L）共用，以抵消因額外加入HEPES引發(fā)的滲入壓增加。在這種培養(yǎng)條件下，細胞培養(yǎng)瓶的蓋子應擰緊，以避免培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。大多數(shù)培養(yǎng)液中含有酚紅作為pH批示劑，酸性培養(yǎng)液呈橙黃色，堿性培養(yǎng)液呈深紅色。

維生素

在細胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素重要來源，但是許多培養(yǎng)基中添加了多個維生素以適合更多的細胞系生長。

其它成分

在某些較為復雜的培養(yǎng)液中還涉及其它某些成分。如在雜交瘤技術(shù)中慣用的DMEM培養(yǎng)液，使用時還需要補加丙酮酸鈉和2-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol，2-Me）。2-Me對細胞生長有很重要的作用。有人認為它相稱于胎牛血清，有直接刺激細胞增殖作用。2-Me的活性部分是硫氫基，其中一種重要作用是使血清中含硫的化合物還原成谷胱甘肽，能誘導細胞的增殖，為非特異性的激活作用。同時避免過氧化物對培養(yǎng)細胞的損害。另一種重要作用是增進分裂原的反映和DNA合成，增加植物凝集素(PHA)對淋巴細胞的轉(zhuǎn)化作用，已廣泛應用于雜交瘤技術(shù)，另外，也開始用于某些難以培養(yǎng)的細胞。2-Me是一種小分子還原劑，極易氧化。分子量為78.13，純的2-Me是一種無色有刺激味的液體，比重為1.110-1.120(Do20)，慣用終濃度為5×10-5M。常配制成0.1M的儲存液，用時每升培養(yǎng)液加0.5ml。

液體培養(yǎng)基保存：

液體培養(yǎng)基應于4℃冰箱避光保存，實驗前放入37℃預熱。未加血清液體培養(yǎng)基有效期為12個月。液體培養(yǎng)基中的L-谷氨酰胺會隨著儲存時間的延長而慢慢分解。如果細胞生長不良，能夠再添加適量L-谷氨酰胺。

干粉培養(yǎng)基保存：4℃冰箱避光保存，使用期36個月。

血清

細胞培養(yǎng)液中添加的血清有牛血清、馬血清、人血清等，其中牛血清是最慣用的血清，分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清，價格昂貴。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來的血清，如廠家能做到這一點，新生小牛血清的質(zhì)量與胎牛血清的質(zhì)量相差不大。如小牛出生后已哺乳，從這種小牛中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質(zhì)，其質(zhì)量明顯不如前兩種。

血清的質(zhì)量，種類及使用的濃度都有可能影響細胞的生長，而不同批次的血清支持細胞生長的能力也不同，特別是對克隆細胞的生長，某些批次血清可能含有毒性或克制細胞生長的物質(zhì)。因此，在購置大量血清之前，必須對血清支持細胞生長能力進行檢測，然后再，然后大量購置質(zhì)量好的同一批號的血清，并注意下列幾點：

（1）需要長久保存的血清必須儲存于-20℃–70℃低溫冰箱中。4℃冰箱中保存時間切勿超出1個月。由于血清結(jié)冰時體積會增加約10％，因此，血清在凍入低溫冰箱前，必須預留一定體積空間，否則易發(fā)生污染或玻璃瓶凍裂。

（2）普通廠商提供的血清為無菌，無需再過濾除菌。如發(fā)現(xiàn)血清有懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)液內(nèi)一起過濾，切勿直接過濾血清。

（3）瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法：-20℃至-70℃低溫冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1天。然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過程中需不停輕輕搖晃均勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。切勿直接將血清從-20℃進入37℃解凍，這樣因溫度變化太大，容易造成蛋白質(zhì)凝集而出現(xiàn)沉淀。

（4）熱滅活是指56℃,30分鐘加熱已完全解凍的血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱解決的目的是使血清中的補體成分（complement）滅活。除非必須，普通不建議作此熱解決，由于熱解決睬造成血清沉淀物明顯增多，并且還會影響血清的質(zhì)量。補體參加反映有：細胞毒作用,平滑肌細胞收縮,肥大細胞和血小板釋放組胺,增強吞噬作用,增進淋巴細胞和巨噬細胞發(fā)生化學趨化和活化。

（5）切勿將血清在37℃放置太久，否則血清會變得渾濁，同時血清中的有效成分會破會而影響血清質(zhì)量。

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