酰基輔酶硫酯酶在脂肪酸代謝中的作用

酰基輔酶硫酯酶在脂肪酸代謝中的作用

1?；趸竌硫酯酶a氨基丙烯酸酶（aco3）廣泛出現(xiàn)于原核生物和真核生物中，并存在于真核生物的細(xì)胞液、長(zhǎng)江三角洲和其他代謝體中。?；o酶A硫酯酶按照系統(tǒng)命名法進(jìn)行了劃分,人類(lèi)中相關(guān)的酶用大寫(xiě)字母表示(如ACOT1),大鼠和小白鼠中的酶使用小寫(xiě)字母表示(Acot1)。Acots按照酶的分子量分為兩類(lèi)(類(lèi)型Ⅰ和類(lèi)型Ⅱ),類(lèi)型Ⅰ包含Acotl-Acot6,類(lèi)型Ⅱ有Acot7-Acot13。兩類(lèi)Acots之間沒(méi)有明顯的序列相似性,但是各個(gè)類(lèi)內(nèi)部的?；o酶A硫酯酶擁有高度的序列相似性。酰基輔酶A硫酯酶能夠催化水解?；o酶A酯類(lèi)中的硫酯鍵來(lái)產(chǎn)生輔酶A(CoASH以及相應(yīng)的非酯化的脂肪酸。Acots催化各種輔酶A酯類(lèi)的復(fù)合物,包括飽和的、不飽和的和支鏈的脂肪酸,膽汁酸,二羧酸和前列腺素。目前在哺乳動(dòng)物中檢測(cè)到的含有?；o酶A的組織和器官有大腦、肝臟、腎、心臟、肺和生成固醇類(lèi)的組織中等。?；o酶A硫酯酶1(ACOT1/Acot1,以前也被稱(chēng)作CTE-1,LACH2和ACH2),在小鼠的大腦、心臟、肝臟和睪丸內(nèi)均有發(fā)現(xiàn),這種細(xì)胞質(zhì)酶主要催化飽和的脂肪族的酰基輔酶A酯類(lèi)的水解,在鼠科中酶的含量受到高濃度的底物的抑制(小白鼠和大鼠中的長(zhǎng)鏈?；o酶A的濃度分別大于20μM和50μM),此外,這種酶的表達(dá)還受到空腹和糖尿病的誘導(dǎo)。人類(lèi)基因組中編碼4種I型的酰基輔酶A硫酯酶(ACOT1,ACOT2,ACOT4,ACOT6),這幾種酶之間的序列具有高度的保守性,但是每種酶都催化不同的底物。這些酶在C末端包含一個(gè)α/β水解酶區(qū)域并且包含一個(gè)Ser-His-Asp的催化三聯(lián)體氨基酸,在酶的N端包含一個(gè)“β-三明治”區(qū)域。到目前為止,I型的酰基輔酶A硫酯酶的晶體結(jié)構(gòu)只有ACOT2的晶體結(jié)構(gòu)得到了解析。本文利用生物信息學(xué)的方法得到了ACOT1中存在的有害突變的蛋白序列,利用同源建模的方法得到了ACOT1和ACOT1＿M(jìn)ULT的結(jié)構(gòu)模型,計(jì)算并分析了突變對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響,從非共價(jià)鍵之間的相互作用探究了造成這種結(jié)果的原因。本文的研究結(jié)果對(duì)于闡明序列突變對(duì)蛋白結(jié)果和功能的影響具有很好的借鑒意義,同時(shí),為基于新形成的活性口袋的藥物的篩選工作提供了很好的靶點(diǎn)。2方法2.1生物信息學(xué)的相關(guān)分析本研究從/Multigenome＿summaries/網(wǎng)站中下載了公共數(shù)據(jù)Complete＿PublicGenomes54genomes＿B37＿mkvcf.vcf數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息＿＿學(xué)的相關(guān)分析,首先對(duì)變異中的數(shù)據(jù)進(jìn)行功能篩選,保留發(fā)生的非同義突變,影響剪切位點(diǎn)及導(dǎo)致獲得終止密碼子的SNP位點(diǎn),然后對(duì)保留的SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行雜合度的篩選,將突變中的發(fā)生純合突變的SNP進(jìn)行保留,利用ANNOVAR對(duì)保留的SNP進(jìn)行功能注釋,并用SIFT,PolyPhen2,LRT,MutationTaster這4款軟件對(duì)保留的SNP進(jìn)行氨基酸置換預(yù)測(cè),4個(gè)軟件均預(yù)測(cè)到了ACOT1中的有害突變位點(diǎn)c.G565A:p.A189T。2.2模型的建立與序列的優(yōu)化已有文獻(xiàn)報(bào)道ACOT1和ACOT2的序列同源性為93%,利用同源建模軟件Modeller以ACOT2的晶體結(jié)構(gòu)中的A鏈為模板,構(gòu)建出了ACOT1的野生型(ACOT1)和突變型(ACOT1＿M(jìn)ULT)模型,由于ACOT2的晶體結(jié)構(gòu)中殘基HIS437-GLY441部分缺失,在同源建模的過(guò)程中,為了使構(gòu)建的模型更準(zhǔn)確,我們對(duì)ACOT1模型中相應(yīng)的序列進(jìn)行了優(yōu)化,并選擇其中能量最低的構(gòu)象作為分子動(dòng)力學(xué)模擬的初始結(jié)構(gòu)。2.3水進(jìn)行區(qū)域能量的大力前處理動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中使用GROMACS軟件包作為處理蛋白的主要程序,采用Amber力場(chǎng)中的ff99SB力場(chǎng)用于描述ACOT1中的參數(shù),為了使體系呈電中性,模擬前加入抗衡離子Na+來(lái)中和體系,采用含有TIP3P水分子的立方體的水盒子模型,溶質(zhì)同水盒子邊緣之間的最小間距設(shè)定為10。組氨酸的離子狀態(tài)通過(guò)使用GROMACS中的程序pdb2gmx程序來(lái)決定,組氨酸的質(zhì)子化狀態(tài)通過(guò)整個(gè)體系的氫鍵網(wǎng)絡(luò)按照一個(gè)簡(jiǎn)單的幾何學(xué)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)決定。為了移除體系中的空間位阻,采用下面的方法進(jìn)行體系的最小化:先固定體系中的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行5000步的最陡下降法的能量?jī)?yōu)化,接著進(jìn)行5000步的共軛梯度法的能量?jī)?yōu)化,最后在不加限制的情況下重復(fù)上面的2個(gè)過(guò)程。在優(yōu)化之后,將體系在NVT系宗中從0K加熱到300K。模擬前體系進(jìn)行500ps的構(gòu)象平衡,模擬過(guò)程中采用PME(ParticleMeshEwald)算法來(lái)非鍵結(jié)的相互作用,閾值設(shè)置為10A,采用SHAKE算法來(lái)處理與H原子共價(jià)相連的原子,積分步長(zhǎng)設(shè)置為2fs,每2ps保存一次軌跡坐標(biāo)。蛋白結(jié)構(gòu)的可視化軟件選用VMD。3實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析3.1n端區(qū)域?qū)钚灾行姆€(wěn)定活性區(qū)域的作用ACOT1具有和ACOT2相同的N端區(qū)域和C端區(qū)域,其中N端區(qū)域包含一個(gè)“β-三明治”區(qū)域,由7個(gè)β折疊組成,其中一個(gè)P折疊片由3個(gè)短的β折疊組成,另外一個(gè)β折疊片由4個(gè)長(zhǎng)的β折疊組成,雖然N端區(qū)域并不是組成活性中心區(qū)域的部分,但第4個(gè)和第5個(gè)β折疊之間的長(zhǎng)Loop區(qū)域,對(duì)于穩(wěn)定活性區(qū)域有重要的作用(如圖1)。C末端區(qū)域包含α/β水解酶區(qū)域,中心部分包含8個(gè)β折疊和5個(gè)α螺旋,這8個(gè)β折疊被5個(gè)α螺旋所包裹,并且這8個(gè)β折疊是相互平行的,活性中心位于連接α螺旋和β折疊的Loop區(qū)域,由一個(gè)三聯(lián)體的氨基酸組成,分別為SER232,ASP326和HIS360?；钚灾行牡纳喜坑幸粋€(gè)Loop形成的“蓋子”(LEU374-SER380),這個(gè)“蓋子”區(qū)域起到了保護(hù)活性中心的作用。氨基酸的突變位點(diǎn)發(fā)生在α/β水解酶區(qū)域的第4個(gè)β折疊的末端氨基酸ALA189位置。3.2結(jié)構(gòu)波動(dòng)情況在動(dòng)力學(xué)過(guò)程中,為了查看體系最終是否達(dá)到了穩(wěn)定的狀態(tài),分別計(jì)算了2個(gè)體系中殘基的α碳相對(duì)于模擬初始結(jié)構(gòu)的均方根偏差(RootMeanSquareDeviation,RMSD)的波動(dòng)情況,圖2顯示了野生型體系和突變體系殘基的Cα原子的坐標(biāo)相對(duì)于初始結(jié)構(gòu)的變化情況,從圖中可以看出,當(dāng)模擬時(shí)間達(dá)到7ns時(shí)2個(gè)體系慢慢向平衡過(guò)渡,當(dāng)模擬時(shí)間達(dá)到8ns時(shí),2個(gè)體系均已達(dá)到了穩(wěn)定狀態(tài)。ACOT1和ACOT1＿M(jìn)ULT,2個(gè)體系穩(wěn)定時(shí)的RMSD分別為2.3A和2.1。3.3模擬參數(shù)設(shè)置上的氫鍵氫鍵在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性上起到了重要的作用,由于突變位點(diǎn)發(fā)生在一個(gè)β折疊的末端,并且突變后的氨基酸蘇氨酸(THR189)為極性的親水性氨基酸,含有極性的羥基基團(tuán),為了研究殘基突變后對(duì)氫鍵造成的影響,分析了ACOT1和ACOT1＿M(jìn)ULT體系中突變附近的氫鍵在分子動(dòng)力學(xué)中的氫鍵的數(shù)量以及氫鍵所占的百分比(如表1所示)。分子動(dòng)力學(xué)過(guò)程中,ACOT1體系在ALA189殘基附近形成的氫鍵有PHE164-TYR190,GLU194-ARG140和ASP195-ARG145。ACOT1＿M(jìn)ULT體系在相應(yīng)的突變位置THR189殘基附近形成的氫鍵有PHE164-TYR190,GLY169-THR189,GLU194-ARG140和ASP195-ARG145。從表中可以發(fā)現(xiàn),氨基酸突變后,THR189與相鄰的160Loop區(qū)域的氨基酸GLY169形成了新的氫鍵,模擬過(guò)程中氫鍵所占的百分比為74%。通過(guò)進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn),由于模擬的初始階段殘基之間的位置取向的原因使得在模擬的前1ns的時(shí)間內(nèi)并沒(méi)有氫鍵的形成,但在后面的模擬過(guò)程中氫鍵所占的比例達(dá)到了80%～95%之間,說(shuō)明了THR189-GLY169在模擬過(guò)程中形成了穩(wěn)定的氫鍵。由于ARG140位于α/β水解酶區(qū)域的第一個(gè)β折疊片末端的位置,GLU194和ARG140殘基位于突變位置所在的Loop區(qū)上。ARG145殘基位于第2個(gè)β折疊片初始的位置,突變前后GLU194-ARG140之間氫鍵所占比率的上升和ASP195-ARG145之間氫鍵所占比率的下降更有利于突變位置附近的β折疊和160Loop區(qū)域向外部的極性溶劑的方向發(fā)生扭轉(zhuǎn)。3.4模型結(jié)構(gòu)距離分析疏水相互作用也是穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的又一重要的因素,在模擬過(guò)程中,本研究分析了位于活性中心上面的“蓋子”區(qū)域(對(duì)應(yīng)的殘基為L(zhǎng)EU374-SER380)與相鄰160Loop(α/β水解區(qū)域的第3個(gè)β折疊的末端區(qū)域)區(qū)域之間的疏水相互作用的變化。為了便于研究疏水相互作用,分別從2個(gè)Loop區(qū)域中選取了2個(gè)具有代表性的殘基的中心作為計(jì)算相互之間距離的端點(diǎn),“蓋子”區(qū)域選取的殘基為ALA376和LEU377,相鄰的Loop區(qū)選取的代表性的殘基為GLY167和GLY168。計(jì)算之后的結(jié)果如圖3所示。從圖中可以發(fā)現(xiàn)ACOT1體系中,2個(gè)Loop區(qū)域之間的距離在模擬初始階段距離在5A左右,隨著模擬時(shí)間的延長(zhǎng),2個(gè)Loop區(qū)域之間的距離逐漸縮小,當(dāng)模擬達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時(shí),它們之間的距離維持在3A左右,表明它們之間已經(jīng)靠疏水相互作用達(dá)到了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定狀態(tài)。在ACOT1＿M(jìn)ULT體系中,從模擬開(kāi)始時(shí)2個(gè)Loop當(dāng)模擬達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時(shí),2個(gè)Loop之間的距離已經(jīng)超過(guò)了7A,說(shuō)明它們之間的相對(duì)位置發(fā)生了很大的變化,由此可得出它們之間已經(jīng)不存在疏水的相互作用。3.5外在結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)變化為了更加直觀的觀察分子動(dòng)力學(xué)過(guò)程中2個(gè)體系的變化情況,研究中分別提取出了2個(gè)體系在分子動(dòng)力學(xué)模擬中最后2ns內(nèi)的穩(wěn)定的構(gòu)象進(jìn)行分析,并將提取出的穩(wěn)定時(shí)的構(gòu)象與模擬初始時(shí)的構(gòu)象進(jìn)行對(duì)比,觀察活性中心以及活性中心附近的Loop區(qū)域以及殘基的變化情況,具體的對(duì)比后的結(jié)果如下圖(圖4)所示,從圖中可以看出,在ACOT1體系中(圖4(a)和圖4(b)),突變殘基ALA189THR附近的Loop區(qū)域以及活性中心附近的“蓋子”區(qū)域(圖4(a)中畫(huà)線部分)相互靠近,使得2個(gè)Loop區(qū)域之間的距離逐漸縮小,起到了很好的保護(hù)內(nèi)部的活性中心的作用?；钚灾行膬?nèi)部的三聯(lián)體氨基酸(SER232,ASP326和HIS360)在動(dòng)力學(xué)過(guò)程中相對(duì)于初始結(jié)構(gòu)并沒(méi)有發(fā)生太大的變化。為了更加形象的展示活性中心附近的“蓋子”區(qū)域的變化,用表面化的方式展示了整個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)(圖4(b)),從圖中可以發(fā)現(xiàn),活性中心附近的2個(gè)Loop區(qū)域已經(jīng)穩(wěn)定的結(jié)合在了一起,形成了一個(gè)類(lèi)似于“橋”狀的結(jié)構(gòu),活性中心的三聯(lián)體氨基酸位于“橋”的下面,這個(gè)結(jié)構(gòu)的形成更有利于在活性中心周?chē)纬梢粋€(gè)疏水性“蓋子”,使得配體或抑制劑分子穩(wěn)定的結(jié)合在活性中心的內(nèi)部。在ACOT1＿M(jìn)ULT體系中,由于殘基ALA189突變成了帶有極性的羥基基團(tuán)的THR,從上面氫鍵的分析過(guò)程中可以發(fā)現(xiàn),突變位點(diǎn)與相鄰的Loop區(qū)域內(nèi)的氨基酸形成了新的氫鍵,使得此Loop區(qū)域朝著突變位點(diǎn)所在的第4個(gè)β折疊的末端Loop區(qū)域拉伸(圖4(c)中右下方的畫(huà)線部分),對(duì)應(yīng)的活性口袋上面的“蓋子”區(qū)域也在分子動(dòng)力學(xué)過(guò)程中發(fā)生了很大的偏移(圖4(c)中右上方的畫(huà)線部分),從圖4(c)中可以發(fā)現(xiàn),分子動(dòng)力學(xué)過(guò)程中活性中心的催化三聯(lián)體氨基酸的相對(duì)位置并沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。將突變后的ACOT1＿M(jìn)ULT體系分子動(dòng)力學(xué)的穩(wěn)定構(gòu)象通過(guò)表面化的方式顯示后的結(jié)果(圖4(d))發(fā)現(xiàn),活性中心上方的“蓋子”區(qū)域在動(dòng)力學(xué)過(guò)程中丟失,蛋白的活性中心暴露在親水性的環(huán)境中。由此可以發(fā)現(xiàn),突變后新的氫鍵的形成不僅影響到了與其相鄰的Loop區(qū)域的變化,同時(shí)也間接的影響到了活性中心上面的“蓋子”區(qū)域的變化。4gly139突變本研究用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法研究了氨基酸突變對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)造成的影響。通過(guò)氫鍵及疏水作用的分析發(fā)現(xiàn)氨基酸突變后蛋白活性中心的“蓋子”區(qū)域丟失,致使蛋白的活性中心暴露在親水的環(huán)境中,改變了活性中心周?chē)慕Y(jié)構(gòu),同時(shí)也影響了活性中心和