基于熒光定量pcr分析的氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌的垂直分布

基于熒光定量pcr分析的氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌的垂直分布

硝化作用是原生動物參與的重要因素。硝化作用的過程也在農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)、生物技術(shù)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。硝化作用主要包括2個過程,因而硝化微生物也相應(yīng)的包括兩大類:一類是將氨氧化成亞硝酸鹽的微生物,即氨氧化微生物(ammonia-oxidizingmicroorganisms,AOM);另一類是將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽的微生物,即亞硝酸鹽氧化菌(nitriteoxidizingbacteria,NOB)。其中由氨氧化微生物催化完成的氨氧化階段是硝化作用的限速階段［１～３］,因此,氨氧化微生物在全球氮循環(huán)中的作用尤為重要。在之前的100多年內(nèi),氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizingbacteriaAOB)一直被認(rèn)為是進(jìn)行氨氧化的唯一微生物,但最近從環(huán)境中檢測到的泉古菌amo基因［４，５］說明氨氧化古菌(am-monia-oxidizingarchaeaAOA)可能也參與了環(huán)境中的氨氧化作用。Kue56ennek等［６］從熱帶海洋水族箱中的巖石基質(zhì)分離到第一株氨氧化古菌(AOA)(nitrosopumilismaritimus),最近,Torre等［７］從熱泉沉積物中分離培養(yǎng)得到一株嗜熱氨氧化古菌(candidatusnitrosocaldusyellowstonii),Hatzen-pichler等［８］從熱泉中分離到一株中等嗜熱氨氧化古菌(candidatusnitrososphaeragargensis)。這些已經(jīng)培養(yǎng)的氨氧化古菌(AOA)具有將氨氧化成亞硝酸鹽、固定無機(jī)碳的能力,且在有機(jī)碳存在條件下,其生長受到抑制［９］。在不同的環(huán)境中,氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的數(shù)量比不一樣。在一些土壤、河口沉積物、熱泉沉積物以及海洋水生態(tài)環(huán)境中,AOAamoA基因的數(shù)量高于AOBamoA基因的數(shù)量,甚至沒有檢測到AOB的amoA基因［１０～１４］。這可能是由于這些環(huán)境中,氨濃度較低,或者環(huán)境條件比較極端造成的,因為相對于AOB來說,AOA能適應(yīng)氨濃度較低的環(huán)境,對酸堿度和溫度的適應(yīng)范圍也較寬［９］。但是,在一些環(huán)境樣品中也發(fā)現(xiàn)細(xì)菌amoA基因的數(shù)量高于古菌amoA基因的數(shù)量,如在浮游水生植物的根際,AOB的數(shù)量是AOA的10倍左右［１５］;Santoro等［１６］發(fā)現(xiàn),在土壤含水土層的好氧鹽水部分,AOB的數(shù)量是AOA的30多倍。在氨濃度較高的環(huán)境,或者非極端的環(huán)境中,環(huán)境條件能夠同時滿足AOB和AOA的生長,由于菌種差異,AOB的生長速率可能高于AOA,從而造成這些環(huán)境中AOB的數(shù)量多于AOA,Herrmann等［１７］在模擬的河流環(huán)境中,也確實發(fā)現(xiàn)了AOB較于AOA表現(xiàn)出更好的生長能力。Wuchter等［１８］研究發(fā)現(xiàn)在海洋水體中,亞硝酸鹽(NO２－)和硝酸鹽(NO３－)的含量與AOA的數(shù)量成正相關(guān)的關(guān)系,這說明海洋環(huán)境中的氨氧化過程可能主要是由AOA參與完成的。然而在陸地環(huán)境中的情況卻是相反的。很多研究發(fā)現(xiàn)土壤中的硝化作用速率是與AOB的數(shù)量成正比,而與AOA之間的關(guān)系并不明顯［１９，２０］。這說明不同的環(huán)境中,參與氨氧化過程的主要微生物并不一樣,而且,同一環(huán)境中,隨著環(huán)境條件的改變,參與完成氨氧化過程的主要微生物也可能發(fā)生改變［２１］。由于AOA和AOB生長慢,代時長,很多類群無法培養(yǎng),采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法難以對其進(jìn)行研究,然而,氨氧化細(xì)菌(AOB)具有較近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,因此特別適合采用PCR的方法分析他們的群落結(jié)構(gòu)和多樣性［２２］。amo基因是微生物氨氧化過程中必須的基因,在氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)進(jìn)行氨氧化的過程中,amo基因編碼的氨單加氧酶(ammoniamonooxygenaseamo)能夠催化氨(NH３)轉(zhuǎn)化為羥胺(NH２OH),進(jìn)而由細(xì)胞色素c催化,將羥胺轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽。因此,amoA基因常用于對氨氧化微生物進(jìn)行定量的目的基因［２３］。氨氧化作用對淡水湖泊、尤其是富營養(yǎng)湖泊中氮元素的循環(huán)具有重要意義。淡水湖泊沉積物中AOA和AOB數(shù)量分布和群落結(jié)構(gòu)是認(rèn)識氮形態(tài)轉(zhuǎn)化和富營養(yǎng)化過程的重要方面。向燕等［２４］對沉積物中AOA和AOB群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,但進(jìn)一步的數(shù)量分布研究能進(jìn)一步的認(rèn)識硝化作用的空間變化規(guī)律。通過分子生物學(xué)的方法,研究AOA和AOB在貴陽百花湖(N26°39′E106°31′)沉積物中的垂直分布,目的在于定量地認(rèn)識AOA和AOB在淡水沉積物中的空間變化規(guī)律以及它們之間的豐度比例關(guān)系,從而為認(rèn)識湖泊沉積物中氮循環(huán)過程及湖泊富營養(yǎng)變化規(guī)律提供微生物方面的依據(jù)。1a基因的定量分析2012年9月,從貴陽市百花湖中(N26°39′E106°31′)采集不同深度的沉積物樣品(1~30cm),按1cm的間隔分樣。樣品置于4℃冰箱保存,用于提取DNA。用土壤DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.SoilDNAkit,OMEGAbio-tek,USA)提取沉積物總DNA,采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗提取情況,測定沉積物DNA在260、280nm處的吸光值,檢驗DNA濃度和純度。DNA樣品儲存于零下20℃的環(huán)境中,用于后續(xù)的qPCR分析。AOA和AOB的amoA基因的定量分析在7500real-timePCR系統(tǒng)(AppliedBiosystemsbylifetechnologiesＴＭ,Singapore)上進(jìn)行,該系統(tǒng)反應(yīng)程序包括3個階段:變性、退火和延伸。熒光染料為RealMasterMixSYBRGreen染料(TianGenBio-tech,Beijing)。每個樣品做3個平行實驗,取算術(shù)平均值。AOAamoA基因的定量,以AOAamo_F:5’-ATGGTCTGGCTAAGACGMTGTA-3’和AOAa-moARa:5’-GCGGCCATCCATCTGTATGT-3’作為引物。25μL反應(yīng)體系包含12.5μLRealMasterMixSYBRGreen染料,正向引物和反向引物各1μL,9.5μL去離子水,DNA模板1μL。反應(yīng)條件為:變性階段:95℃持續(xù)4min;退火階段:95℃持續(xù)45s,55℃持續(xù)45s,72℃持續(xù)45s,循環(huán)次數(shù)45次;延伸階段:72℃持續(xù)10min。AOBamoA基因的定量,以AOBamoA-1F:5’-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3’和AOBamoA-2Ra:5’-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3’作為引物。25μL反應(yīng)體系包含12.5μLRealMasterMixSYBRGreen染料;正向引物和反向引物各1μL;9.5μL去離子水;DNA模板1μL。反應(yīng)條件為:變性階段:95℃持續(xù)4min;退火階段:95℃持續(xù)60s,55℃持續(xù)45s,72℃持續(xù)60s,循環(huán)次數(shù)45次;延伸階段:72℃持續(xù)10min。AOA和AOB的amoA基因標(biāo)準(zhǔn)樣品分別進(jìn)行10倍系列稀釋。與樣品同時進(jìn)行PCR反應(yīng),分別構(gòu)建AOA和AOB的標(biāo)準(zhǔn)曲線。2結(jié)果與討論2.1不同深度和深度下沉積物中aoa的群落組成采用定量氨單加氧酶基因(amoA)的熒光定量PCR方法分析了百花湖不同深度沉積物的AOA豐度。以氨單加氧酶基因(amoA)數(shù)量來衡量氨氧化古菌(AOA)數(shù)量。結(jié)果表明,百花湖沉積物中AOA的amoA基因數(shù)量在1.74×10５~2.00×10６拷貝/克沉積物(濕重)之間。這說明AOA在百花湖沉積物中的數(shù)量存在較大的差異。其中在1~21cm的沉積物中,AOA的數(shù)量變化不大,基本上都在5.00×10５拷貝/克沉積物(濕重)左右,而在22~30cm的沉積物中,部分層面中AOA數(shù)量增加1.00×10６拷貝/克沉積物(濕重)以上(圖1)。造成這種變化的原因可能有2種:1由于百花湖深層沉積物(22~30cm)的環(huán)境條件相對于淺層(1~21cm)沉積物發(fā)生了利于AOA生存的變化。環(huán)境中的pH值、氧化還原點(diǎn)位、溫度、有機(jī)物、鹽度等物理化學(xué)因素以及其他微生物與氨氧化菌(AOA和AOB)的相互作用(如微生物之間的捕食作用)都會影響其在環(huán)境中生長繁殖［６，１６，２５］。隨著沉積物深度的增加,沉積物中的某些微生物數(shù)量由于理化因素的改變可能會減少,百花湖沉積物中AOA的數(shù)量可能正是由于這些微生物(如與AOA存在競爭、拮抗或捕食作用的微生物)的減少而增加。2由于AOA在百花湖沉積物中隨深度而變化,其群落組成發(fā)生了變化。向燕等［２４］研究了太湖沉積物的1~7cmAOA的群落結(jié)構(gòu)垂直分布情況,發(fā)現(xiàn)AOA的群落結(jié)構(gòu)沒有顯著變化,本文研究發(fā)現(xiàn)百花湖1~30cm沉積物中AOA數(shù)量在1~21cm沉積物中AOA的數(shù)量變化不大,但在22cm以后,AOA的數(shù)量卻有明顯的變化,其原因可能是22cm以后的沉積物中AOA的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,從而造成此段沉積物中AOA數(shù)量的增多。但是,1~21cm處AOA的數(shù)量變化不大并不能說明這一段沉積物中AOA的群落組成就沒有變化,因此需要進(jìn)一步對百花湖沉積物中AOA的群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行分析,以更深入的了解其在沉積物中的垂直分布情況。2.2aod基因在淡水湖泊的分布以氨單加氧酶基因(amoA)數(shù)量來衡量氨氧化菌(AOB)數(shù)量。沉積物中AOB豐度的垂直分布研究結(jié)果表明,AOB豐度在6.10×10６~3.88×10７拷貝/g沉積物(濕重)之間,平均1.33×10７拷貝/g沉積物(濕重)AOBamoA基因在百花湖沉積物中的數(shù)量隨深度的增加變化不大(圖2),可能原因是:1AOB的群落組成發(fā)生了變化,通過群落組成的改變使得AOB總的數(shù)量保持在基本穩(wěn)定的狀態(tài),在其他的研究中也確實發(fā)現(xiàn)了淡水湖泊不同深度沉積物中AOB的優(yōu)勢菌種存在差異［２４］;2百花湖沉積物中對AOB具有生態(tài)作用的環(huán)境條件未發(fā)生改變或者改變程度并沒有超出AOB的耐受范圍,因而AOB的群落組成和數(shù)量變化不大。圖2中29cm處,AOB的數(shù)量出現(xiàn)了一個峰值,其數(shù)值為AOB數(shù)量平均值的3倍左右。在此處出峰值的原因更可能是由AOB自身的群落組成發(fā)生變化,或者由AOB群落組成和環(huán)境條件同時變化引起的。2.3aod與aoa的數(shù)量對氨單加氧酶(amoA)基因的定量結(jié)果表明,在百花湖沉積物中AOB的數(shù)量遠(yuǎn)高于AOA的數(shù)量,在1~4cm的沉積物中,AOB與AOA的數(shù)量比呈明顯下降趨勢,5~18cm沉積物中這個比例基本穩(wěn)定在20~30,而19cm以后比例則下降并穩(wěn)定在10左右,但在29cm處出現(xiàn)了一個峰值(圖3),從圖1和圖2可以判斷,峰值的出現(xiàn)是由于AOB數(shù)量在此處的增加造成的,AOB數(shù)量的增加則可能是由于環(huán)境條件或者AOB自身群落結(jié)構(gòu)的變化而引起的。從AOB與AOA的數(shù)量來看,在百花湖沉積物中AOB是參與氨氧化作用的主要微生物,但隨著沉積物深度的增加,AOA對整體氨氧化作用的貢獻(xiàn)會增加。很多對河口沉積物的研究都得到AOA的數(shù)量高于AOB的結(jié)論［２６，２７］。一般地,河口沉積物中的鹽度相對于淡水湖泊較高,因此這2種環(huán)境中AOA和AOB數(shù)量可能由于鹽度的不同而出現(xiàn)截然相反的現(xiàn)象。由此引出一個問題,是否所有的淡水湖泊中AOB的數(shù)量都會高于AOA的數(shù)量呢?這需要對更多的淡水湖泊中AOB和AOA的數(shù)量進(jìn)行研究來驗證這個問題。3貝/g沉積物中的aod和aoa-amoa基因數(shù)量分布(1)AOA的數(shù)量在百花湖沉積物中存在比較明顯的分層現(xiàn)象,其中深層沉積物(22~30cm)是淺層沉積物(1~21cm)的2倍左右。(2)AOB在百花湖沉積物各層的數(shù)量基本上變化不大,以氨單加氧酶基因(amoA)數(shù)量來衡量,平均值為1.33×10７拷貝/g沉積物(濕重)。但是在8~12cm處出現(xiàn)了一個低峰,在這一段沉積物中,AOB的數(shù)量0.75×10７拷貝/g沉積物(濕重)左右。(3)在百花湖沉積物中,AOB的數(shù)量比AOA的數(shù)量多,且AOB與AOA在各層沉積物中的數(shù)量比也存在較明顯的分層現(xiàn)象,