紫葉李葉片色素種類及含量分析

紫葉李葉片色素種類及含量分析

紫色葉李是薔薇科的一種獨特的落葉樹種。與其他紅葉樹種相比，它具有生長速度快、樹型優(yōu)良、觀賞時間長等特點。廣泛應用于園林綠地和觀賞植物，效果好。近年來,隨著經(jīng)濟的不斷發(fā)展,人們對園林綠化的重視程度不斷提高,國內(nèi)外出現(xiàn)越來越多關(guān)于觀賞樹種花、葉等器官的成色機制與環(huán)境影響因素相關(guān)性的研究成果。Deal的研究表明紅葉雞爪槭Acerpalmatum會因晝夜溫差變大而出現(xiàn)葉色褪失的現(xiàn)象;彩葉秋海棠Begoniapurpureofolia和紫葉矮櫻Prunuscistena‘Pissardii’會在較強光照下呈現(xiàn)深紫色,若光照減弱,葉片中花青苷合成量減少,導致葉色偏綠影響最佳觀賞效果;萬壽菊Tageteserecta葉片中花青苷的合成與低溫、高輻射和高光強等諸多環(huán)境因素有關(guān);紫葉李、金葉接骨木Sambucusracemosa的日照時間超過12h時,葉片顏色會更加鮮艷。到目前為止,對紫葉李葉色的研究多集中于內(nèi)外環(huán)境與花青苷的相關(guān)性分析,對其葉片各類色素的提取與成分的定性、定量分析未有報道。本研究從紫葉李葉片中提取相關(guān)色素,并運用紫外-可見分光光度計、薄層層析色譜法和高效液相色譜儀對提取的色素進行定性與定量分析,確定了其葉片成色的主要色素成分,以期為紫葉李品種改良、利用基因工程等手段調(diào)控葉片成色機制研究奠定理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1試驗材和試材制備采集生長于西北農(nóng)林科技大學南校區(qū)內(nèi)的紫葉李向陽面紫紅色葉片為試材,采集時間為2012年6月。將采集的葉片表面用流水沖洗干凈,輕柔吸干表面水珠后置于-80℃冰箱內(nèi)保存待用。1.2材料和標品的制備試劑中色譜級甲醇、乙腈購自Spectrum公司;類黃酮標準樣品根皮素、對香豆酸和蘆丁購自天津一方科技有限公司;表兒茶素、槲皮素和兒茶素購自天津金測分析技術(shù)有限公司;其余標品均購自Sigma公司。儀器為高效液相色譜-二極管陣列檢測儀(日立L-2000)、紫外-可見分光光度計(島津-2450)。1.3測試方法1.3.1材料預處理2結(jié)果與分析2.1葉綠素及類黃酮類化合物類胡蘿卜素的吸收峰位于400~500nm。紫外分光光度計檢測結(jié)果表明,紫葉李葉片的類胡蘿卜素萃取液在這個區(qū)間內(nèi)有2個吸收峰(圖1A,峰1和峰2),表明葉片中含有類胡蘿卜素(圖1A,峰2),根據(jù)類胡蘿卜素定量方法計算得到類胡蘿卜為0.76mg·g-1。葉綠素的吸收峰區(qū)間為600~700nm。紫葉李葉片的葉綠素萃取液在662nm處檢測到吸收峰(圖1B,峰3),這與葉綠素a的特征吸收峰(663nm)相符,表明紫葉李葉片中有葉綠素的存在,且葉綠素a較多。根據(jù)葉綠素定量方法計算得到葉綠素a為1.69mg·g-1,葉綠素b為1.06mg·g-1,葉綠素總為2.74mg·g-1?；ㄇ嘬蛰腿∫旱淖贤夥止夤舛扔嫏z測結(jié)果表明:在283nm(圖1D,峰7)和533nm(圖1D,峰8)處有2個特征吸收峰,這2個峰均位于類黃酮化合物的特征吸收峰區(qū)間內(nèi)(280nm附近和500~550nm),說明紫葉李葉片內(nèi)含有黃酮類化合物。將紫葉李葉片水解液也進行紫外分光光度計檢測。結(jié)果顯示:紫葉李葉片水解液在283nm(圖1E,峰9)和536nm(圖1E,峰10)處有吸收高峰,說明可能存在花青素類的矢車菊素和飛燕草素。向上述水解液中加入體積分數(shù)為5%氯化鋁后,可見光區(qū)的最大吸收峰波長由533nm移動到535nm,說明紫葉李葉片中所含花青苷可能是矢車菊素、矮牽牛素和飛燕草素中的一種或多種。類黃酮化合物除了花青苷/素之外,還包括黃酮、黃酮醇、二氫黃酮醇等。對甲醇萃取液在200~600nm范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描,結(jié)果顯示:在270nm(圖1C,峰4),290nm(圖1C,峰5)和369nm(圖1C,峰6)處有吸收峰,說明紫葉李葉片中可能含有二氫黃酮醇、黃酮醇和黃烷酮類物質(zhì)。根據(jù)總黃酮測定方法,得到標準品蘆丁的吸光度D(λ)與標準液質(zhì)量濃度(c)的標準曲線方程:c=0.5378D(λ)-0.008,R2=0.9999,計算得到紫葉李葉片甲醇萃取液中總黃酮的質(zhì)量分數(shù)為38.68mg·g-1。據(jù)此初步推測,紫葉李葉片呈現(xiàn)紅色的主要原因可能是花青素大量積累的結(jié)果,同時也伴有其他黃酮類化合物的存在。2.2多紅色控制點對應rf值將紫葉李水解萃取液在5種流動相中展開,觀察到薄層板上均有1個紅色斑點(圖2),其對應Rf值如表1所示。與矢車菊素和矢車菊素半乳糖苷標準品的Rf值對比發(fā)現(xiàn),紫葉李葉片中主要的花青素種類可能為矢車菊素半乳糖苷及其他矢車菊素衍生物。2.3花青苷及其他類黃酮化合物檢測將經(jīng)薄層層析分析后刮板并重復萃取的紫葉李葉片花青苷水解液用HPLC-DAD進行檢測,在22.09,24.38,25.05min處檢測到3個吸收峰,這與標準品矢車菊素、矮牽牛素、天竺葵素的出峰時間基本一致,推斷萃取液中有矢車菊素、矮牽牛素和天竺葵素(圖3,峰1~3)的存在。確定母體色素后,進而檢測其自然狀態(tài)下花青苷的組成,在18.50,19.30,19.72min處檢測到吸收峰,與標準品矢車菊素半乳糖苷、蕓香苷、阿拉伯糖苷的出峰時間基本一致,推斷為矢車菊素半乳糖苷、蕓香苷、阿拉伯糖苷(圖4,峰4~6),其中大部分是矢車菊素的衍生物,還有少量糖苷和矮牽牛素及天竺葵素結(jié)合成花青苷。除花青苷外,還有其他類黃酮化合物在紫葉李葉片成色過程中起輔助作用,甲醇萃取液檢測到10種我們已鑒定出的類黃酮(圖5,峰7~16),其保留時間依次為26.89,30.90,31.62,32.01,33.53,34.44,38.02,39.32,44.97,46.55min,與標準品表兒茶素、二氫楊梅酮、蘆丁、對香豆酸、香豆酸、二氫槲皮素、根皮苷、楊梅素、槲皮素、芹菜素的保留時間是相同的,推斷萃取液中存在這10種化合物。根據(jù)所得標準曲線方程對這些化合物進行定量分析,結(jié)果如表2所示。圖5中出現(xiàn)的s1和s2等個吸收峰尚未鑒定出其對應的化合物種類,還需后續(xù)試驗進行進一步的鑒定分析。單體酚標準樣品液相圖譜見圖6。3紫葉李葉片的結(jié)構(gòu)變化紫葉李初春芽為紅色,展葉后顏色逐漸加深,盛夏滿株嬌艷紫紅,是園林綠化樹種中紅色葉保持時間最為持久的樹種之一。植物葉片所含主要成色色素有葉綠素、類胡蘿卜素、類黃酮和甜菜堿色素等到目前為止,甜菜堿色素只在少數(shù)幾種植物中分離得到,并且尚未發(fā)現(xiàn)其與花青苷同時存在于同一植物細胞組織中。在對紫葉李葉片的不同萃取液進行分析時,均未檢測到甜菜堿色素的特征吸收峰,據(jù)此推斷,紫葉李葉片中不存在有甜菜堿類色素。通過高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器對紫葉李葉片的甲醇鹽酸萃取液及水解液進行分析,檢測到矢車菊素與矢車菊素半乳糖苷同時存在于萃取液中,數(shù)據(jù)顯示,矢車菊素半乳糖苷的質(zhì)量分數(shù)(4600.00±11.50mg·kg-1)遠遠高于矢車菊素質(zhì)量分數(shù)(168.00±0.3mg·kg-1),而薄層層析分析中只觀察到1個斑點(矢車菊素半乳糖苷),可能是因為紫葉李中花青苷多以矢車菊素衍生物的形式存在,而矢車菊素太少導致無法在層析板上觀察到。此外,除含有矢車菊素半乳糖苷和矢車菊素外,紫葉李葉片中還含有少量的矮牽牛素和天竺葵素?；ㄇ嘬疹惿厥羌t色葉植物成色的主要色素,但其他黃色或無色色素也起著重要作用,在它們的輔助下,植物葉片才呈現(xiàn)出飽滿的色彩在植物中,花青苷和葉綠素的質(zhì)量分數(shù)比會影響其所在器官顏色的呈現(xiàn),因此,紫葉李中兩者的存在及相對含量對其葉片顏色的加深有很大影響。經(jīng)檢測,紫葉李葉片細胞液的pH5.20,通常來說,偏酸性(pH5.00~5.50)環(huán)境下矢車菊素半乳糖苷的顏色為亮紅色,而紫葉李成熟葉片的顏色為紫紅色,導致這種現(xiàn)象的原因可能是葉綠素(2744.00mg·kg-1)與矢車菊素半乳糖苷(4600.00mg·kg-1)的共同存在與相互作用。紫葉李葉片中還含有槲皮素、楊梅素、蘆丁、芹菜素、二氫楊梅素、二氫槲皮素、表兒茶素、根皮苷、類胡蘿卜素等物質(zhì),它們作為輔助色素對紫葉李葉色的形成也起著一定的作用。取保存于-80℃冰箱中的紫葉李葉片,真空冷凍干燥72h后研磨成粉待用。1.3.2葉綠素提取葉綠素與類胡蘿卜素萃取參考高俊鳳的方法并改進。在葉綠素萃取方法中,先稱取0.50g粉末,再用體積分數(shù)為90%丙酮溶液[V(丙酮)∶V(乙醇)=9∶1]萃取并定容至20.0mL,然后放置于4℃冰箱冷藏室萃取48h。類胡蘿卜素萃取,稱取0.50g粉末,用V(丙酮)∶V(石油醚)=1∶1提取,定容至20.0mL,提取條件同葉綠素萃取?；ㄇ嘬盏妮腿⒄誏i的方法,稱取1.00g粉末,用體積分數(shù)為1%的甲醇鹽酸(97.0mL甲醇+3.0mL體積分數(shù)為36%的鹽酸)萃取,定容至25.0mL,完全遮光后放置在4℃冰箱冷藏室中萃取24h,將上清轉(zhuǎn)入新的容器中4℃遮光保存,再向殘渣中加入25.0mL甲醇鹽酸,相同條件下萃取12h,重復該操作2次,將3次萃取液的上清合并,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后用甲醇鹽酸定容至25.0mL。花青苷萃取液的水解參照辛轉(zhuǎn)霞的方法并加以改進,吸取600.0μL甲醇鹽酸萃取液與750.0μL的2.0mol·L-1鹽酸混勻,恒溫(95℃)加熱45min。加熱后迅速冰上冷卻,加入370.0μL異戊醇劇烈震蕩混勻,4℃下6000rmin-1離心5min,待混合液分層后,將上相移至新的離心管中用于檢測。其他類黃酮的萃取參照Li的方法,稱取1.00g粉末,用25.0mL甲醇溶液超聲提取3次,合并萃取液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后并定容至25.0mL。1.3.3總黃酮質(zhì)量分數(shù)a用紫外可見分光光度計分別檢測上述萃取液的吸收峰及吸光度,波長范圍為200~700nm。葉綠素和類胡蘿卜素的含量測定以文獻中的方法作為參考;總黃酮的含量測定采用中國藥典所記載的方法:用蘆丁(rutin)為樣品,制備梯度標準液,510nm波長下測定吸光度值,得到質(zhì)量濃度(c)與吸光度D(λ)的標準曲線,然后以紫葉李甲醇萃取液為樣相同條件重復測定3次。紫葉李葉片總黃酮質(zhì)量分數(shù)(mg·g-1)測定的公式為M=10×c×V1/(m×0.2)。c為上述方法求得的總黃酮質(zhì)量濃度(g·L-1);m為樣品干質(zhì)量(g);V1為樣品定容體積(mL);0.2為待測萃取液的所用量(mL);10為測定液終定容體積(mL)?；ㄇ嘬账庖旱臋z測,還需向萃取液中加入200.0μL體積分數(shù)為5%氯化鋁甲醇溶液后再次檢測吸收峰。1.3.4含量測定表2,2顯色染色在色譜上的rf值的測定—薄層層析色譜法(TLC)鑒定色素色素分離用玻璃毛細管虹吸待測萃取液和色素標樣,點滴到纖維素層析板上,放入層析槽用不同的流動相進行色譜分離。該試驗所用流動相為以下5種:Forestal溶液[V(濃鹽酸)∶V(冰乙酸)∶V(水)=3∶30∶10];BAW溶液[V(正丁醇)∶V(冰乙酸)∶V(水)=6∶1∶2];30%HoAc溶液[V(冰乙酸)∶V(水)=3∶7];Formic溶液[V(濃鹽酸)∶V(甲酸)∶V(水)=2∶5∶3];BuHCL溶液[V(正丁醇)∶V(2mol·L-1鹽酸)=1∶1]。萃取液各成分分離后,測定顯色色斑在色譜上的Rf值,即色斑中心距原點的距離與溶劑展開前沿距原點距離的比值。色素鑒定:多種類黃酮呈無色或淡黃色,很難用肉眼觀察到。在本試驗中,首先在正常光照條件下,測量顯色色斑的Rf值,通過與標樣對照確定化合物種類,然后將層析后的纖維素板用紫外光照射,觀察類黃酮的顏色變化,通過對比標樣并參考李玲等的方法進行鑒定。將檢測到的顯色斑點用刀片輕輕刮下,用1.0mL體積分數(shù)為1%的甲醇鹽酸溶液萃取,靜置6h后于14000r·min-1下離心1min,將上清液用0.22μm的濾膜過濾,置于4℃冰箱保存待用。1.3.5流動相及色譜條件本研究所用高效液相色譜儀(L-2000)選用L-24