細(xì)胞培養(yǎng)污染的途徑危害及預(yù)防措施

細(xì)胞培養(yǎng)污染的途徑、危害及防止方法污染是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中面臨的重要問題。由于每一種細(xì)胞有其獨(dú)特的培養(yǎng)體系，因此污染造成的后果也不盡相似。某些污染的發(fā)生往往難以察覺和檢測，并且污染源能長久共存于培養(yǎng)體系中，這類污染事實(shí)上大部分被人們無視了。培養(yǎng)的細(xì)胞作為一種生物體，會對培養(yǎng)環(huán)境以及環(huán)境中的污染物作出對應(yīng)的反映，造成培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的變化，而對實(shí)驗(yàn)成果造成潛在的威脅，并且隨著污染時(shí)間的延長而增加。培養(yǎng)環(huán)境中的物理、化學(xué)及生物因素都可能侵入培養(yǎng)環(huán)境造成污染。由于入侵的微生物在培養(yǎng)體系中不停增殖、代謝，因此生物性的污染對細(xì)胞的危害最大。隨著污染微生物的不停增殖，交叉污染的可能性也不停增加。另外，微生物代謝消耗大量必需的養(yǎng)分，同時(shí)產(chǎn)生多個有毒的代謝產(chǎn)物，如酶、抗原及毒素等，進(jìn)一步對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。因此，認(rèn)識細(xì)胞培養(yǎng)污染的途徑及其危害性，建立細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范的操作辦法及規(guī)章制度，能夠有效地避免污染，確保明驗(yàn)體系的穩(wěn)定性和可靠性。1細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)為了減少污染對細(xì)胞培養(yǎng)的影響，必須建立細(xì)胞凍存庫。細(xì)胞凍存庫應(yīng)當(dāng)分主細(xì)胞庫（Mastercellbank，MCB）和工作細(xì)胞庫（Workingcellbank，WCB），當(dāng)需要做實(shí)驗(yàn)時(shí)從主細(xì)胞庫中復(fù)蘇細(xì)胞建立工作細(xì)胞庫。每一種凍存標(biāo)本都應(yīng)明確統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的性質(zhì)、代數(shù)及有無污染。同時(shí)還應(yīng)建立規(guī)范的檢測程序進(jìn)行菌檢及細(xì)胞鑒定［1］。為了確保培養(yǎng)細(xì)胞系的完整性，必須進(jìn)行具體的實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，應(yīng)涉及下列內(nèi)容：細(xì)胞系的種類及來源、有無污染（如細(xì)菌，病毒，支原體）、細(xì)胞代數(shù)和倍增時(shí)間、以及選擇性突變。具體的統(tǒng)計(jì)有助于對細(xì)胞的遺傳及生理特性在常規(guī)傳代培養(yǎng)中因突變、污染及多個因素造成的變化進(jìn)行分析。通過持續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞與它較早代數(shù)的凍存細(xì)胞相比，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞在適應(yīng)環(huán)境的過程中，其生物特性已發(fā)生了變化。培養(yǎng)的細(xì)胞由若干生長速度及活力各異的亞群構(gòu)成。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，生長速度快及活力高的細(xì)胞亞群逐步占優(yōu)勢，這種選擇性趨勢會影響整個細(xì)胞群的生物特性。應(yīng)用不同代數(shù)的細(xì)胞持續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)則成果會發(fā)生偏差。建立細(xì)胞凍存庫就能避免這種影響，通過復(fù)蘇相似代數(shù)的細(xì)胞，人們就能在較為均一的條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)工作需要清潔，保持良好的環(huán)境及規(guī)范的操作程序［2，3］。超凈工作臺是細(xì)胞培養(yǎng)中普遍使用的無菌操作裝置，它需要合理的布置及經(jīng)常性的維護(hù)。超凈工作臺的工作原理是驅(qū)動經(jīng)高效濾菌凈化后的空氣，通過工作臺面形成氣流屏障，從而制止外界污染物的侵入并使操作過程中產(chǎn)生的飛沫限制在超凈工作臺中。由于操作過程中可能產(chǎn)生有毒的物質(zhì)，因此采用垂直氣流比水平氣流安全。當(dāng)進(jìn)行移液，傾倒液體的操作過程會產(chǎn)生飛沫，并沉積在超凈工作臺內(nèi)物體的表面。超凈工作臺的氣流并不能制止飛沫的產(chǎn)生，飛沫會隨著氣流的方向飄浮。超凈工作臺不合理的放置、不恰當(dāng)?shù)木S護(hù)以及不規(guī)范的使用會破壞超凈工作臺氣流的方向，造成飛沫更廣泛的沉積。酒精燈的火焰、操作者的活動、談話、咳嗽及打噴嚏都有可能影響氣流。飛沫的沉積是造成超凈工作臺內(nèi)物品污染的重要因素，造成潛在污染的進(jìn)一步傳輸。因此為減少交叉污染的發(fā)生，應(yīng)盡量減少超凈工作臺內(nèi)的物品。不同細(xì)胞系以及同一種實(shí)驗(yàn)室不同操作者所使用的培養(yǎng)試劑一定要分開使用，如胰酶、培養(yǎng)液等。否則，一種操作者的失誤可能引發(fā)全部細(xì)胞發(fā)生污染。2細(xì)胞培養(yǎng)的污染細(xì)胞培養(yǎng)污染是指培養(yǎng)環(huán)境中侵入了對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞變異的異物。細(xì)胞培養(yǎng)污染可分為下列三類：物理性、化學(xué)性及生物性［2，3］。為了使細(xì)胞培養(yǎng)的成果更可靠，應(yīng)當(dāng)固定全部培養(yǎng)條件，并確保其重復(fù)性。2.1物理性污染的來源、危害及防止物理性污染經(jīng)常被人們所無視或被籠統(tǒng)地歸為化學(xué)性污染。物理性污染通過影響細(xì)胞培養(yǎng)體系中的生化成分，從而影響細(xì)胞的代謝。培養(yǎng)環(huán)境中的物理因素，如溫度、放射線、振動、輻射(紫外線或熒光)會對細(xì)胞產(chǎn)生影響［2］。細(xì)胞、培養(yǎng)液或其它培養(yǎng)試劑暴露于放射線、輻射或過冷過熱的溫度中，能夠引發(fā)細(xì)胞代謝發(fā)生變化，如細(xì)胞同時(shí)化、細(xì)胞生長受克制甚至細(xì)胞死亡。通過實(shí)驗(yàn)室的合理設(shè)計(jì)及建立規(guī)范的操作規(guī)程，能夠減少環(huán)境中物理因素對細(xì)胞的影響。孵箱應(yīng)放在溫度較恒定的環(huán)境中，周邊不能放置能引發(fā)機(jī)械振動的設(shè)備，如離心機(jī)。培養(yǎng)液及培養(yǎng)試劑應(yīng)放在固定的位置，為避免光照試劑不能放在玻璃門的冰箱中，試劑周邊不能放同位素。培養(yǎng)液從冰箱中取出后應(yīng)在室溫中放置一段時(shí)間后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以避免過冷的溫度對細(xì)胞的影響。2.2化學(xué)性污染的來源、危害及防止培養(yǎng)環(huán)境中許多化學(xué)物質(zhì)都能夠引發(fā)細(xì)胞的污染［2］。化學(xué)物質(zhì)并不總是克制細(xì)胞的生長，某些化學(xué)物質(zhì)如激素就可增進(jìn)細(xì)胞的生長。不同細(xì)胞對化學(xué)物質(zhì)污染的反映是不同的。未純化的物質(zhì)、試劑、水、血清、生長輔助因子及儲存試劑的容器都可能成為化學(xué)性污染的來源。細(xì)胞培養(yǎng)的必需養(yǎng)分，如氨基酸，若濃度超出了適宜的范疇，也會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。同樣，不同細(xì)胞系其最佳培養(yǎng)條件下對血清和緩沖液的規(guī)定是不同的，在培養(yǎng)中應(yīng)嚴(yán)格控制。玻璃制品清洗過程中殘留的變性劑或肥皂(普通殘留在瓶蓋的內(nèi)表面)是最常見的化學(xué)性污染。2.2.1水水是唯一一種在凝固時(shí)膨脹的化合物。因此在選擇凍存細(xì)胞的容器時(shí)應(yīng)考慮到這個因素。容器因水的膨脹而發(fā)生破裂是引發(fā)試劑污染的重要因素。為了避免金屬離子、有機(jī)分子、細(xì)胞內(nèi)毒素等物質(zhì)對水的污染，在配制液體，清洗容器時(shí)必須使用不含雜質(zhì)的超純水［4］。需要注意的是，超純水放置過久其純度會下降。在高壓蒸氣滅菌及蒸餾水時(shí)水經(jīng)常被污染，由于高壓蒸氣鍋及純水機(jī)的常規(guī)維護(hù)后可能有少量的化學(xué)物質(zhì)殘留。為了確保水的純度，我們應(yīng)采用方法盡量避免化學(xué)物質(zhì)的殘留。2.2.2血清動物血清是細(xì)胞培養(yǎng)中慣用的天然培養(yǎng)基，但血清又是潛在的生物及化學(xué)污染的來源。由于血清采集于多個動物，并且不同廠商的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量各不相似，因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。血清對不同細(xì)胞的促生長能力及毒副作用取決于這些細(xì)胞的分化功效、組織來源及培養(yǎng)基的成分等因素。在進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)時(shí)，為了確保明驗(yàn)的可重復(fù)性，最佳選用同一批次的血清。2.2.3培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑都可能成為化學(xué)性污染的來源。細(xì)胞培養(yǎng)使用的全部物質(zhì)都應(yīng)是高純度的，并通過權(quán)威機(jī)構(gòu)的鑒定，實(shí)驗(yàn)者本人也應(yīng)對上述成分進(jìn)行純度鑒定。同時(shí)，對的配備和儲存培養(yǎng)液及試劑也是非常重要的，應(yīng)當(dāng)采用原則的操作環(huán)節(jié)，避免液體體積計(jì)算錯誤，混用類似化合物等錯誤。2.2.4培養(yǎng)器皿及容器細(xì)胞培養(yǎng)過程中會使用到多個不同的培養(yǎng)器皿及容器。培養(yǎng)器皿的大小，構(gòu)形設(shè)計(jì)可能會影響到培養(yǎng)中氣體交換、濕度、培養(yǎng)液的pH值和細(xì)胞生長密度。培養(yǎng)器皿的工藝及滅菌過程中的差別可能對培養(yǎng)體系產(chǎn)生影響。塑料制品在生產(chǎn)過程中可能殘留某些有毒成形劑，生產(chǎn)工藝的不同可能引發(fā)器皿表面附著能力的不同。儲存不同物質(zhì)時(shí)應(yīng)選用適宜的塑料或玻璃容器，由于酒精、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿能夠溶解塑料或玻璃的某些成分。2.3生物性污染的來源、危害及防止外界的微生物如昆蟲、節(jié)肢動物、原蟲、霉菌、病毒、細(xì)菌、無細(xì)胞壁的微生物（普通指支原體）和其它類型的細(xì)胞都可能侵入培養(yǎng)環(huán)境引發(fā)污染［2，3］。只要在一種開放的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，都難以避免發(fā)生污染。發(fā)生污染的可能性取決于操作辦法、培養(yǎng)室的無菌環(huán)境以及實(shí)驗(yàn)室的規(guī)章制度。生物性污染對細(xì)胞代謝的影響，可因污染源和細(xì)胞的種類不同而體現(xiàn)各異。細(xì)菌、真菌或其它微生物污染的檢測能夠用不同培養(yǎng)基進(jìn)行檢查［5］。支原體污染的檢測需要特殊的辦法。病毒污染的檢測能夠使用許多體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)，涉及大鼠或小鼠的接種、逆轉(zhuǎn)錄酶分析、凝血實(shí)驗(yàn)、紅細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)等。細(xì)菌和真菌的污染較易發(fā)現(xiàn)并及時(shí)去除，而大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室對支原體的污染缺少足夠的認(rèn)識。為了避免支原體及其它微生物污染的發(fā)生和傳輸，必須建立規(guī)范的無菌操作程序及多個規(guī)章制度。支原體歸屬于柔膜體綱（Mollicutes）的支原體目，它們都含有下列共性：無細(xì)胞壁、無細(xì)胞壁重要成分——粘肽的體現(xiàn)。支原體與其它細(xì)菌不同之處還在于其胞膜中含有膽固醇或其它甾醇，這種特性使支原體膜更具柔順性，對于物理因素，如壓力、滲入壓、脫水的抵抗力很大［3］。支原體直徑僅有0.3～0.8μm，并且變形能力大，故能通過濾菌器。需要指出的是，只要有一種含有增殖能力的支原體就能引發(fā)培養(yǎng)體系的污染。一旦細(xì)胞被污染，支原體的滴度隨著時(shí)間的延長而逐步升高，最高可至每毫升109克隆。最為致命的是，即使存在很嚴(yán)重的支原體污染，細(xì)胞外觀可無明顯變化。如果繼續(xù)使用這種已被支原體污染，而貌似正常的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)，將會嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)成果。2.3.1來源培養(yǎng)體系中支原體污染的最可能途徑是經(jīng)已被支原體污染的細(xì)胞擴(kuò)散和傳輸。細(xì)胞被支原體污染后，支原體能夠與宿主細(xì)胞形成一種共生體系，使污染不停擴(kuò)大。一旦發(fā)生支原體污染，支原體和其它微生物會隨著飛沫而不停傳輸。操作過程中移液，傾倒液體時(shí)都會產(chǎn)生含有潛在感染能力的飛沫，并沉積在接觸到的表面。這種污染性飛沫能存活數(shù)天甚至數(shù)星期。另外，操作失誤引發(fā)的交叉污染也是支原體污染的一種常見途徑。人體的組織及體液成分是細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的重要來源。污染的細(xì)胞中普通能分離到人類口腔支原體、發(fā)酵支原體、唾液支原體以及其它某些與人有關(guān)的支原體，如M.buccale，M.faucium，M.homonis，M.pirum和生殖支原體等。無菌操作過程中，操作者能產(chǎn)生有污染性的隨空氣傳輸?shù)娘w沫和微粒，造成培養(yǎng)體系的污染。人體外周血、骨髓、淋巴組織原代培養(yǎng)中有可能發(fā)生發(fā)酵支原體的原發(fā)污染（primarycontamination），這也證明支原體在分化細(xì)胞中較未分化細(xì)胞更易生長。隨著培養(yǎng)技術(shù)的不停發(fā)展，人們已能培養(yǎng)來自不同物種如動物、植物、昆蟲的多個細(xì)胞，同時(shí)也擴(kuò)大了支原體及其它微生物的宿主范疇。另外，某些支原體，如菜氏無膽甾原體科（Acholeplasmalaidlawii）、M.arginini、M.hyorhinis、口腔支原體、唾液支原體能寄生不同的宿主，并能在培養(yǎng)體系中穩(wěn)定增殖數(shù)年。牛血清中能分離到A.laidlawii、M.arginini和M.hyorhinis支原體，因此血清可能成為支原體污染的來源。由于無血清培養(yǎng)基中許多附加成分及試劑是從血清或其它生物制品中制備的，因此無血清培養(yǎng)體系并不能排除支原體污染的危險(xiǎn)。盡管隨著培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，血清發(fā)生污染的可能性進(jìn)一步減少，但只要有一種活的支原體能通過濾菌器，整個培養(yǎng)體系就會被污染。2.3.2危害支原體通過產(chǎn)生代謝產(chǎn)物及消耗多個養(yǎng)分，如核酸前體及必需氨基酸，從而變化細(xì)胞的代謝狀態(tài)。支原體能夠酵解糖，分解精氨酸，氧化丙酮酸，解脲支原體能夠運(yùn)用尿素作為能源，這會使細(xì)胞代謝發(fā)生一系列變化，從而影響蛋白質(zhì)、DAN、RNA合成以及嘌呤從頭合成及賠償合成途徑。污染時(shí)間的長短及核酸代謝變化決定了支原體污染造成的危害程度，造成細(xì)胞染色體斷裂、重排、非整倍體的出現(xiàn)。隨即，細(xì)胞的生長特性發(fā)生變化，使某些酶和細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加，并體現(xiàn)出某些特殊的細(xì)胞功效，而其它某些細(xì)胞正常的功效則被克制。某些支原體附著在細(xì)胞表面后，會與宿主細(xì)胞交換膜抗原成分。隨著細(xì)胞膜成分的變化，細(xì)胞的形態(tài)及抗原性發(fā)生變化。細(xì)胞污染對研究工作帶來的最大危害是由于錯誤的實(shí)驗(yàn)成果造成研究誤入歧途。另外，支原體污染還會干擾細(xì)胞的篩選，如雜交瘤細(xì)胞生長受到克制并喪失產(chǎn)生單抗的能力（附表）。附表支原體污染對細(xì)胞的影響分類可能的危害1雜交瘤技術(shù)1融合細(xì)胞無分泌單抗的能力2雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單抗不是針對靶抗原，而是針對支原體3支原體消耗胸腺嘧啶，干擾HAT*篩選4在HAT篩選過程中喪失了雜交瘤細(xì)胞2細(xì)胞遺傳學(xué)1造成羊水污染2姊妹染色單體交換增多3染色體隨機(jī)斷裂和畸變增多4產(chǎn)生額外的染色體5干擾羊水培養(yǎng)的成果6精子污染后受精能力下降7染色體數(shù)目減少3病毒學(xué)1轉(zhuǎn)錄酶活性下降2干擾某些逆轉(zhuǎn)錄病毒的分離3減少禽痘病毒的感染力及空斑的形態(tài)4誘導(dǎo)人單核細(xì)胞產(chǎn)生干擾素5克制腺病毒的增殖6誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生干擾素7污染病毒疫苗8引發(fā)巨細(xì)胞病毒及帶狀病毒形成假空斑9減少腺病毒及SV40胸腺嘧啶的摻入10克制腺病毒和單純皰疹病毒的增殖11克制脊髓灰質(zhì)炎病毒和牛痘病毒的增殖12支原體與病毒在蔗糖梯度離心中共沉淀13克制新城病病毒（NDV）產(chǎn)生干擾素14喪失HIV敏感細(xì)胞4代謝1減少鳥氨酸脫羧酶的產(chǎn)生2減少蛋白質(zhì)和RNA的產(chǎn)生3消耗培養(yǎng)液中的精氨酸4變化尿苷／尿氨酸的比例5減少DNA和RNA的合成6增加胸腺嘧啶的降解7誘導(dǎo)3T3細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶8增加致癌物誘導(dǎo)芳香烴羥化酶的產(chǎn)生9增進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞的增殖10減少嘌呤替代途徑11減少ATP水平12減少脫氫酶的水平13減少氧的消耗14克制胸腺嘧啶的摻入5生物反映性1引發(fā)鼠的淋巴細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化2增進(jìn)腫瘤壞死細(xì)胞因子的釋放3克制同種抗原引發(fā)的細(xì)胞毒性反映4誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性因子5增進(jìn)支原體與宿主細(xì)胞交換抗原6產(chǎn)生類淋巴因子的活性7變化成淋巴樣細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白8誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗支原體的多克隆抗體9克制某些淋巴細(xì)胞的分裂10對胸腺細(xì)胞產(chǎn)生毒性11活化鼠的巨噬細(xì)胞*HAT：次黃嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷系統(tǒng)2.3.3防止及控制污染發(fā)生后首先應(yīng)擬定污染物的種類及污染的程度。為了能對的檢測細(xì)菌或支原體的污染，應(yīng)先撤去培養(yǎng)液中的抗生素。常規(guī)細(xì)胞傳代培養(yǎng)中應(yīng)用抗生素會造成：①掩蓋了不很嚴(yán)重的污染；②造成了耐藥菌的產(chǎn)生。每一種抗生素的抗菌譜都是有限的，并且許多抗生素僅是克制細(xì)菌生長，而非殺菌劑。由于支原體無細(xì)胞壁，因此青霉素，頭孢菌素等干擾細(xì)胞壁合成的抗生素對于支原體無效。菌檢及支原體檢測只有在撤去抗生素后才干進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中若發(fā)生污染或其它問題應(yīng)有具體的統(tǒng)計(jì)，并由經(jīng)驗(yàn)豐富的專家分析，找出哪個環(huán)節(jié)出了問題，涉及培養(yǎng)液的配備、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的保持和無菌操作過程等，從而不停完善操作規(guī)程，避免類似問題的出現(xiàn)。另外，管理者還應(yīng)制訂細(xì)胞培養(yǎng)的各項(xiàng)規(guī)章制度，教育每一種實(shí)驗(yàn)人員恪守。實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人應(yīng)根據(jù)狀況，制訂修改各項(xiàng)規(guī)范的操作程序及人員培訓(xùn)計(jì)劃。普通來說，隨著實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的擴(kuò)大，細(xì)胞發(fā)生變異和污染的可能性增加了［5］。因此，大型實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格制訂各項(xiàng)操作程序及規(guī)章制度。細(xì)胞培養(yǎng)中無菌操作需要清潔的工作環(huán)境、實(shí)驗(yàn)的合理安排、實(shí)驗(yàn)者純熟的操作技巧及強(qiáng)烈的責(zé)任感。只有通過不停地學(xué)習(xí)、訓(xùn)練，才干純熟掌握無菌操作技術(shù)。為了盡量減少污染的發(fā)生，以常規(guī)檢查的方式來監(jiān)督是必要的。細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)生污染是不可避免的，我們的目的是盡量減少污染的發(fā)生及危害。根據(jù)美國實(shí)驗(yàn)室的調(diào)查報(bào)告顯示，最少10％的細(xì)胞系存在支原體的污染［2］。一旦發(fā)生污染，如果細(xì)胞有具體的統(tǒng)計(jì)，則污染引發(fā)的危害較小。我們能夠根據(jù)細(xì)胞定時(shí)菌檢統(tǒng)計(jì)，拼棄最后一次細(xì)胞菌檢陰性后的實(shí)驗(yàn)成果。運(yùn)用菌檢陰性的細(xì)胞重新開始實(shí)驗(yàn)。如果僅偶然進(jìn)行菌檢或采用非特異檢測辦法，特別是支原體污染，那么擬定污染的范疇比較困難。由于全部的細(xì)胞系都有可能被交叉污染。一旦發(fā)生污染，全部未進(jìn)行菌檢的凍存細(xì)胞都必須進(jìn)行菌檢，以去除污染的細(xì)胞并明確污染發(fā)生的時(shí)間。2.3.4檢測由于支原體污染并不引發(fā)細(xì)胞外觀的明顯變化，故常規(guī)的支原體檢測非常必要的。人們可運(yùn)用一系列直接或間接的辦法檢測支原體。但由于支原體種類的多樣性，現(xiàn)在還沒有一種方便、廣譜、特異性高、精確的檢測辦法。因此，有必要對不同檢測辦法的敏捷度及局限性有所理解。不同檢測辦法對送檢標(biāo)本的規(guī)定不同，如果標(biāo)本不合格，將不可能獲得對的的成果。血清、培養(yǎng)液或培養(yǎng)基附加成分在加工和儲存過程中污染會在一定程度上被稀釋，影響檢出率［6］。間接檢測法由于其敏感性較差，若不采用濃縮標(biāo)本，則不合用于檢測血清和培養(yǎng)液的污染。由于污染物的隨機(jī)分布，因此僅進(jìn)行一次檢測普通會出現(xiàn)假陰性［1］。如果標(biāo)本中污染物濃度低于10個污染物／ml，隨機(jī)抽取1ml標(biāo)本進(jìn)行檢測可能有36.6％的假陰性率。增加標(biāo)本體積，濃縮標(biāo)本有助于減少假陰性率。另一種假陰性的產(chǎn)生是由于污染物在試劑瓶，凍存瓶等容器中的分布不均所致。若20個樣品中有一種被污染（5％的污染率），檢測全部20個樣品，假陰率為36.6％。需要指出的是，僅僅單次檢測一種標(biāo)原來判斷有無生物性污染的作法是不可靠的。因此，在分裝液體前，就應(yīng)當(dāng)從原液中盡量多取一點(diǎn)液體進(jìn)行檢測。如果不能做到這一點(diǎn)，則應(yīng)當(dāng)用原則辦法選擇多個標(biāo)本進(jìn)行檢測。例如，在無菌過濾操作中，隨著濾過體積的增大，濾膜破損的可能性增加，故應(yīng)選擇最后過濾的液體進(jìn)行檢測。標(biāo)本的解決與標(biāo)本的選擇同樣重要。多個酶如胰酶、脂酶，強(qiáng)酸，強(qiáng)堿或其它化學(xué)物質(zhì)會破壞支原體膜的脂質(zhì)，使支原體喪失活力及膜的完整性。膜的完整性被破壞后，支原體內(nèi)的蛋白酶及核酶釋放，從而會干擾間接檢測辦法的成果。如果標(biāo)本收集后不能當(dāng)天檢測，則應(yīng)當(dāng)盡快凍存標(biāo)本以避免降解。選擇、解決檢測標(biāo)本的目的是盡量發(fā)現(xiàn)潛在的污染。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中就應(yīng)考慮到支原體污染的檢測。我們最佳選用無抗生素培養(yǎng)，檢測應(yīng)盡量離傳代時(shí)間長一點(diǎn)，方便讓任何潛在的污染物生長、繁殖。為避免支原體活力喪失，如果檢測的是貼壁細(xì)胞，應(yīng)采用刮除細(xì)胞的辦法，由于胰酶或其它生化分離辦法會減少支原體的活性。在選用適宜的檢測辦法時(shí)，應(yīng)考慮到支原體的滴度和活力這兩個因素。直接培養(yǎng)法是最敏感的，但也是最耗時(shí)的檢測辦法，大概需28天。從理論上講，只需一種有活力的支原體就能在培養(yǎng)基上生長。但某些難以培養(yǎng)的支原體限制了直接培養(yǎng)法的應(yīng)用。抱負(fù)的直接培養(yǎng)法應(yīng)采用多功效的培養(yǎng)基，以減少假陰性率［7］。為增加對低滴度和低活力支原體檢出率，應(yīng)采用有氧和無氧兩種培養(yǎng)條件及幾個傳代方式。直接培養(yǎng)法還需要活性支原體作為陽性對照，并且耗時(shí)，操作繁瑣，因而不適于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室。檢測支原體污染的間接法涉及：PCR、ELISA、電子顯微鏡檢查、DNA探針、DNA熒光染色及生化分析法等。間接法能檢測到107／L的滴度。普通狀況下，支原體污染后其滴度普通超出109／L，故盡管間接法不敏感，但相對較精確。由于支原體的多樣性，體現(xiàn)不同特異性的抗原及酶，為生化及免疫檢測法帶來技術(shù)上的困難［8］。在選擇PCR、DNA探針等辦法前，應(yīng)考慮好選擇適宜的靶序列及引物序列。DNA熒光染色法和直接培養(yǎng)法相結(jié)合是支原體檢測的金原則［5］。美國、加拿大、日本和歐共體國家生物制藥及診療的監(jiān)督機(jī)構(gòu)推薦使用這種辦法。其基本原理在于運(yùn)用不同的技術(shù)，多次檢測，以彌補(bǔ)多個檢測技術(shù)的缺點(diǎn)，增加檢測成果的可信度。2.3.5控制及排除控制支原體污染或其它生物性污染的唯一可靠的辦法是全部可能污染的物品用高壓蒸氣滅菌法消毒。全部細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備都應(yīng)消毒，應(yīng)嚴(yán)格恪守上述的各項(xiàng)規(guī)章制度及監(jiān)督制度，直至全部潛在的污染源都被消除。細(xì)胞一旦被支原體污染，要將它去除是非常困難的。由于某些不可復(fù)得的細(xì)胞被污染，人們不得不設(shè)法去除污染，挽救某些貴重的細(xì)胞。事實(shí)上，經(jīng)支原體污染的細(xì)胞，在污染經(jīng)解決被去除后，細(xì)胞原有的許多生物學(xué)特性，如基因的體現(xiàn)，抗原性和代謝特點(diǎn)也隨之發(fā)生了對應(yīng)的變化。排除支原體污染的辦法，涉及使用抗生素、抗血清、裸鼠體內(nèi)接種、巨噬細(xì)胞吞噬、胰酶消化等辦法，但沒有一種辦法是普遍有效的。因此在采用每一種辦法時(shí)必須對其效果，以及對細(xì)胞可能產(chǎn)生的毒性影響進(jìn)行監(jiān)測。DelGuidice和Gardella［6］提出了一種有效的辦法，其基本環(huán)節(jié)涉及首先分離、鑒定污染物及測定對抗生素的敏感性，然后使用最少兩種敏感的抗生素進(jìn)行解決。為增加排除污染的有效性，能夠通過稀釋以減少血清及其它促生長因子的濃度，從而減少細(xì)胞的密度。治療后細(xì)胞應(yīng)在無抗生素條件下培養(yǎng)若干代，以擬定污染已被徹底去除。細(xì)胞培養(yǎng)過程中支原體污染不易察覺，細(xì)胞被支原體污染后去除非常困難，支原體污染的細(xì)胞在支原體被去除后，其細(xì)胞特性會發(fā)生很大變化，對研究成果造成嚴(yán)重影響。因此，為了確保細(xì)胞培養(yǎng)體系免受污染的影響，核心是加強(qiáng)防止方法。作者介紹：李穎健(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士碩士)參考文獻(xiàn)1JohnsonRW.Qualityassuranceoftissueculturemed