電針對炎癥疼痛大鼠下丘腦腦啡肽和脊髓孤啡肽含量的影響

電針對炎癥疼痛大鼠下丘腦腦啡肽和脊髓孤啡肽含量的影響

慢性炎性疼痛是臨床上常見的癥狀，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量?，F(xiàn)在，它引起了國內(nèi)外的關(guān)注。慢性關(guān)節(jié)炎(RheumatoidArthritis,RA)的動物模型有多種,弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(AdjuvantArthritis,AA)是最為經(jīng)典、最為常用的RA實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?可以有效模擬慢性炎癥疼痛。電針對慢性炎癥疼痛有良好的治療效果,對人體無不良反應(yīng),電針治療慢性炎癥疼痛機(jī)理研究取得了很大進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)通過觀察單穴電針對內(nèi)源性阿片肽的影響,探討單穴電針治療慢性炎癥疼痛的可能機(jī)制。1材料表面1.1實(shí)驗(yàn)動物及許可證健康成年SD大鼠,雄性,體重160～180g,清潔級,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2006-0009。隨機(jī)分為4組:正常組、模型組、單側(cè)針刺組、單側(cè)電針組,每組12只。室溫(23±1)℃,自然照明,自由飲水、飲食。1.2弗氏完全佐劑的制備腦啡肽(ENK)、孤啡肽(QFQ)ELISA試劑盒:美國R&D公司生產(chǎn),北京博惠嘉業(yè)生物科技有限公司進(jìn)口分裝。弗氏完全佐劑制備:取凍干卡介苗2支(160mg),80℃,1h滅活,均勻混入滅菌石蠟油、羊毛脂(2:1)16mL,使其含菌濃度為10g/L,制成弗氏完全佐劑。TSC-V1電針刺激儀:由清華大學(xué)研制,恒流輸出模式。2方法2.1慢性炎癥模型在大鼠左后肢足跖皮內(nèi)注射0.1mL含濃度20g/L卡介苗的弗氏完全佐劑,正常飼養(yǎng)10d復(fù)制慢性炎癥模型。文獻(xiàn)報道此方法能提高造模的實(shí)驗(yàn)成功率,且模型鼠間病理變化個體差異小,為較佳且可靠的造模方案。2.2取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》中大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜,取大鼠左側(cè)“足三里”穴(大鼠后膝關(guān)節(jié)外下方當(dāng)腓骨小頭下約5mm處)。2.3動物或動物穿刺正常組:不作任何治療處理。模型組:將大鼠置于特制的塑料筒中,左后肢自然下垂,剃毛,30min后讓動物回籠休息。單側(cè)針刺組:將大鼠置于特制的塑料筒中,左后肢自然下垂,剃毛,針刺左側(cè)“足三里”,但不通電,30min后讓動物回籠休息。每周治療2次(每周一、周四治療),共治療4周。單側(cè)電針組:將大鼠置于特制的塑料筒中,左后肢自然下垂,剃毛,在左側(cè)“足三里”和后肢外側(cè)任意非穴處直刺5mm,連接TSC-V1電針刺激儀,然后給予方波脈沖電刺激。刺激波寬0.3ms,頻率分別為2Hz及100Hz,持續(xù)時間30min,強(qiáng)度1～2～3mA(1mA,2mA,3mA各10min)。每周治療2次(每周一、周四治療),共治療4周。2.4動物踝關(guān)節(jié)測定背屈踝關(guān)節(jié)疼痛實(shí)驗(yàn)評分:將動物裝進(jìn)特制的塑料籠中,兩后腿外露,穩(wěn)定20min后進(jìn)行測定。緩慢背屈大鼠的一側(cè)踝關(guān)節(jié),在10s內(nèi)完成1次,共5次。背屈時動物若無嘶叫或短促而明顯的縮腿反應(yīng),評分為0;若出現(xiàn)一種反應(yīng),評為1分;兩者均出現(xiàn),評為2分。每次刺激所得評分為0～2,總評分為0～10。2.5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和指標(biāo)斷頭取血后,迅速取下丘腦、脊髓腰膨大部位,迅速放入液氮中,后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存待測。采用ELISA法測定OFQ、ENK。2.6比較兩組顯著性差異數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)形式表示,利用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。選用單因素方差分析(Onewayanalysisofvariance,ANOVA)并選用最小顯著差法(Littlesignificantdifference,LSD)進(jìn)行后檢驗(yàn)比較組間顯著性差異。以P<0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。3結(jié)果3.1各組大鼠一般情況比較大鼠模型的制備完成后,表現(xiàn)為致炎側(cè)的關(guān)節(jié)、足跖紅腫,致敏后即可出現(xiàn),18～24h達(dá)峰值,持續(xù)4d后逐漸減輕;繼發(fā)自身免疫應(yīng)答反應(yīng),從足趾波及四肢關(guān)節(jié),且癥狀較原發(fā)時加重,出現(xiàn)足趾紅腫、增厚、觸摸局部皮溫升高,且有豎毛、活動及攝食減少、體重增加減慢、倦怠嗜臥等表現(xiàn)變應(yīng)性角膜翳以及體重下降等,與文獻(xiàn)論述基本一致。單側(cè)針刺組大鼠各時間點(diǎn)評分均小于模型組,但無顯著性差異(P>0.05);單側(cè)電針組大鼠各時間點(diǎn)評分均小于模型組,1、2、3周時有顯著性差異(P<0.05);單側(cè)電針組大鼠各時間點(diǎn)評分均小于單側(cè)針刺組,但無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果見表1。3.2單次電針組與側(cè)腦電針患者中髓ofq和腦電enk含量的比較與正常組比較,模型組脊髓OFQ和下丘腦ENK含量有所升高,但無顯著性差異(P>0.05);單側(cè)針刺組和單側(cè)電針組脊髓OFQ和下丘腦ENK含量均升高,有顯著性差異(P<0.01)。與模型組比較,單側(cè)針刺組和單側(cè)電針組脊髓OFQ和下丘腦ENK含量均升高,呈顯著性差異(P<0.01)。與單側(cè)針刺組比較,單側(cè)電針組脊髓OFQ和下丘腦ENK含量有所升高,但無顯著性差異(P>O.05)。結(jié)果見表2。4針刺對髓內(nèi)發(fā)揮著鎮(zhèn)痛作用慢性疼痛嚴(yán)重影響病人的生存質(zhì)量,目前認(rèn)為慢性疼痛不僅僅是一種癥狀,而且是一類疾病,其中又以慢性炎癥疼痛最為多見,是臨床多學(xué)科面臨的重要問題之一。電針可以通過多途徑發(fā)揮其鎮(zhèn)痛效應(yīng),調(diào)整機(jī)體內(nèi)源性阿片肽分泌和分布是發(fā)揮其作用的重要方面。OFQ由17個氨基酸殘基組成,分子前體(PPOFQ)是一個大分子多肽,含176個氨基酸,兩端被賴氨酸-精氨酸(k-R)酶切位點(diǎn)所分開。OFQ主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng),尤其是與痛覺密切相關(guān)的區(qū)域。在脊髓中OFQ免疫陽性纖維主要分布于脊髓背角表層和側(cè)角?，F(xiàn)有研究表明OFQ對痛覺調(diào)制具有雙向性。有實(shí)驗(yàn)報道,在脊髓水平引起的行為反應(yīng)中,OFQ鞘內(nèi)注射可產(chǎn)生痛覺過敏和異常疼痛,但OFQ在脊髓水平具有和嗎啡類似的鎮(zhèn)痛效應(yīng)在大部分報道中得到證實(shí)。Rossi等報道在甩尾實(shí)驗(yàn)中,小鼠OFQ產(chǎn)生痛敏反應(yīng)后緊接著出現(xiàn)鎮(zhèn)痛作用。對OFQ引起的鎮(zhèn)痛作用,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是由于抑制痛遞質(zhì)釋放,這種作用差別和劑量有關(guān)。一些研究表明低劑量的OFQ產(chǎn)生異常疼痛而高劑量則起鎮(zhèn)痛作用。側(cè)腦室注射OFQ能劑量依賴性減少大鼠伏核多巴胺(DA)釋放,有研究認(rèn)為,OFQ是DA遞質(zhì)內(nèi)源性阻斷劑,競爭性抑制紋狀體突觸傳遞。針刺可以使疼痛大鼠脊髓OFQ含量增加,結(jié)合大鼠的行為學(xué)表現(xiàn),本實(shí)驗(yàn)顯示的結(jié)果與文獻(xiàn)論述的一致,OFQ在脊髓內(nèi)發(fā)揮了鎮(zhèn)痛作用,針刺可以通過增加疼痛大鼠脊髓OFQ的含量發(fā)揮其鎮(zhèn)痛作用,電針的效果優(yōu)于單純針刺。ENK家族是腦內(nèi)含量最高的內(nèi)源性神經(jīng)肽,包括甲硫氨酸腦啡膚(methionine-enkephalin,MEK,5肽)和亮氨酸腦啡肽(leuthine-enkephalin,LEK,5肽)。哺乳動物中,MEK與LEK來源于共同的前腦啡肽原,經(jīng)酶切加工產(chǎn)生。有研究表明內(nèi)源性ENK通過μ受體、δ受體參與構(gòu)成內(nèi)源性痛覺調(diào)制系統(tǒng),發(fā)揮鎮(zhèn)痛功能。大鼠腦室應(yīng)用微量(約200ng)ENK即可產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),大鼠延髓背角ENK可能通過抑制含鈣結(jié)合蛋白的傷害性感受神經(jīng)元來調(diào)節(jié)面口部傷害性信息的傳遞。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明,電針組和針刺組丘