薏苡仁多糖對免疫功能低下小鼠的保護(hù)作用

薏苡仁多糖對免疫功能低下小鼠的保護(hù)作用

自然糖是三種生物活動(dòng)的秘密之一，在決定生命的秘密方面發(fā)揮著重要作用。許多研究證實(shí),多糖對機(jī)體免疫系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用,是其發(fā)揮藥效的主要機(jī)制之一,主要表現(xiàn)為免疫增強(qiáng)或刺激作用,是一類頗具應(yīng)用前景的免疫調(diào)節(jié)劑。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),多糖對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用與它能激活淋巴細(xì)胞(lymphocyte)、巨噬細(xì)胞,誘生和促進(jìn)多種細(xì)胞因子的分泌有密切關(guān)系。天然多糖可起到抗腫瘤,抗病毒,延緩衰老等多種特異生理功能。以薏苡仁多糖(Coixan)純品為研究對象,采用環(huán)磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型,檢測受試小鼠的臟器指數(shù),觀察薏苡仁多糖對小鼠細(xì)胞免疫器官的保護(hù)、修復(fù)效果;以腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為衡量指標(biāo),觀察薏苡仁多糖對小鼠機(jī)體免疫細(xì)胞的特異性和非特異性免疫功能的影響。以綿羊紅細(xì)胞(SRBC)免疫小鼠,測定致敏小鼠的半數(shù)溶血值(HC50)、抗體生成細(xì)胞水平,觀察薏苡仁多糖對小鼠體液免疫功能的調(diào)節(jié)作用,研究薏苡仁多糖對小鼠免疫功能的影響,探討薏苡仁多糖對機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1薏養(yǎng)殖多糖的制備采集當(dāng)年產(chǎn)于福建省仙游縣金沙的薏苡仁,以其為原料,粉碎后過200目篩,脫脂,用淀粉酶降解淀粉后采用熱水浸提,乙醇沉淀、冷凍干燥的方法制備薏苡仁多糖粗品。薏苡仁多糖粗品采用酶-Sevag法脫除蛋白質(zhì),SephadexG-75凝膠色譜層析;用10ku半透膜流動(dòng)蒸餾水透析48h,冷凍干燥得薏苡仁多糖純品,樣品純度≥97%。1.1.2養(yǎng)基、新生牛血清、頂空液、頂層環(huán)磷酰胺(Cy)(批號20071017,規(guī)格200mg×5瓶),江蘇恒瑞制藥廠;RPMI1640培養(yǎng)基、新生牛血清、Hanks液體、都氏液、綿羊紅細(xì)胞(SRBC),美國Hyclone公司;四氮唑鹽(MTT)、刀豆蛋白(ConAⅣ)四型,Sigma公司。ThermoMK3型酶標(biāo)儀,上海熱點(diǎn)儀器有限公司;微量血凝試驗(yàn)板、96孔板、Co-150CO2培養(yǎng)箱,美國;752分光光度計(jì),上海市第三分析儀器廠。1.2動(dòng)物飼養(yǎng)及給藥方式清潔級ICR小鼠60只,體重(20±2)g,由福建省疾病預(yù)防控制中心提供。試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK(閩)2005-0001,試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號SYXK(閩)2005-0001。將小鼠隨機(jī)分為5組,每組12只,雌雄各半,飼以高壓滅菌的嚙齒類動(dòng)物飼料,自由攝水,室溫保持(25±1)℃。分別設(shè)正常組(生理鹽水)、模型組(生理鹽水)、薏苡仁多糖純品高劑量組[1000mg/(kgbwd)]、中劑量組[500mg/(kgbwd)]和低劑量組[250mg/(kgbwd)]。除正常組(生理鹽水)外,其余4組第1周連續(xù)7d腹腔注射0.2mL環(huán)磷酰胺[50mg/(kgbwd)]造模,形成免疫機(jī)能低下。飼養(yǎng)與給藥方式:正常組、模型組每日灌胃0.5mL生理鹽水,其它3組每日分別灌胃高、中、低劑量的薏苡仁多糖溶液各0.5mL,給藥周期28d。小鼠規(guī)格、造模、分組、飼養(yǎng)與給藥方式同本文1.2.1節(jié)。連續(xù)灌胃21d后,D22每鼠腹腔注射0.2mL2%綿羊紅細(xì)胞(SRBC)進(jìn)行免疫,1周后(周內(nèi)繼續(xù)灌胃給藥)測定血清溶血素、抗體生成細(xì)胞。1.3指標(biāo)和方法的測量1.3.1免疫器官指數(shù)的測定連續(xù)灌胃28d后,禁食12h,稱重;頸椎脫臼法處死,無菌剝?nèi)∑⑴K和胸腺,去除周圍脂肪和結(jié)締組織,稱其濕重,計(jì)算臟器指數(shù)。1.3.2刀豆蛋白刺激劑對小鼠的影響1)小鼠脾細(xì)胞懸液的制備無菌取脾臟,置盛有Hank’s液的平皿中,于綱網(wǎng)上剪碎,用針芯輕輕研磨,即單細(xì)胞懸液;1000r/min離心10min,棄上清液,洗滌2次,進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)。細(xì)胞沉淀用C-RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)至含量為1×106/mL。2)取100mL新鮮分離的1×107/mL小鼠脾細(xì)胞懸液于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入100mL刀豆蛋白刺激劑(ConA),每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行孔,并設(shè)對照孔(僅加C-RPMI1640)。每孔總體積200mL,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h,取出平板,棄上清液100mL,分別加入10mL5mg/mLMTT,繼續(xù)培養(yǎng)4h,取出培養(yǎng)板,各加入10%HCL-SDS裂解液(溶于雙蒸水)100mL/孔,繼續(xù)培養(yǎng)8h,取出,用酶標(biāo)儀于570nm處比色測定OD值。1.3.3細(xì)胞培養(yǎng)及測定1)小鼠巨噬細(xì)胞懸液的制備無菌操作。將取血后的小鼠固定于解剖盤,腹腔注無血清的RPMI-1640營養(yǎng)液5mL,撫摸數(shù)分鐘后,剪開腹腔,用巴氏管將營養(yǎng)液吸出至滅菌試管中,2000r/min離心15min。細(xì)胞沉淀用含10%新生牛血清的RPMI-1640營養(yǎng)液洗滌3次,細(xì)胞計(jì)數(shù),配成1×105/mL的溶液。2)將1×105/mL細(xì)胞液以每孔100μL加入96孔板中,每鼠3孔,正常組2孔(同一板共用),于37℃,5%CO2培養(yǎng)4h使巨噬細(xì)胞貼壁;加MTT20μL(5mg/mL孔),同條件繼續(xù)培養(yǎng)4h;加入10%HCL-SDS100μL/孔,繼續(xù)培養(yǎng)8h,測定A570值。吞噬指數(shù)計(jì)算公式:1.3.4不同濃度牛蒡紅細(xì)胞的aod用2%綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠,于末次給藥后24h,眼眶靜脈竇采血。將血液室溫放置1h,3000r/min離心15min分離血清,10μL血清用生理鹽水稀釋100倍。取稀釋血清1mL于試管內(nèi),依次加入0.5mL5%(體積分?jǐn)?shù))綿羊紅細(xì)胞懸液、0.5mL10%補(bǔ)體,在37℃下保溫30min,冰水浴終止反應(yīng)。3000r/min離心10min,取上清液1mL,加都氏液3mL于試管內(nèi),同時(shí)取5%綿羊紅細(xì)胞懸液0.25mL,加都氏液至4mL,置于另一試管內(nèi),作為綿羊紅細(xì)胞的半數(shù)溶血值。充分搖勻,放置10min,于540nm處比色。以不加血清為空白對照,分別測定各管的AOD值。血清溶血素的量以半數(shù)溶血值表示,計(jì)算公式:1.3.5脾細(xì)胞懸液的制備小鼠被采血后,迅速摘取其脾臟,用冰生理鹽水沖洗干凈,配制成15mg/mL的脾細(xì)胞懸液。在試管中依次加入2%綿羊紅細(xì)胞懸液和1∶10豚鼠血清各0.5mL。另設(shè)不加補(bǔ)體的空白對照管,置于37℃水浴中溫育1h,3000r/min離心10min,取上清液于413nm處測定AOD值。1.4方差齊性檢驗(yàn)和多重比較采用lsd采用SPSS10.0軟件包,多組均數(shù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析(ANOVA)和多重比較采用(LSD法),結(jié)果使用表示,顯著水平α=0.05和0.01。2結(jié)果2.1薏養(yǎng)殖大鼠的免疫能力表1數(shù)據(jù)表明,與正常組相比,模型組與給藥組小鼠體重均極顯著下降(p<0.01),表明環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠模型建立成功。飼養(yǎng)過程中還觀察到同組的雄性小鼠體重明顯低于雌性小鼠(2±1)g,皮毛稀疏,沒有光澤,精神狀態(tài)低彌;而雌性小鼠皮毛致密,光滑,精神狀態(tài)好。這種現(xiàn)象可能與環(huán)磷酰胺具有抑制性腺發(fā)育的作用有關(guān)。同時(shí)與模型組相比,給藥組的小鼠體重有不同程度的增加,且呈劑量依賴關(guān)系,其中高劑量組體重增加極顯著(p<0.01)。此外,模型組小鼠的免疫臟器指數(shù)極顯著下降,由正常鼠的脾臟指數(shù)(0.82±0.21)、胸腺指數(shù)(0.17±0.02)分別下降到(0.49±0.07)和(0.12±0.01)(p<0.01),說明環(huán)磷酰胺可造成小鼠免疫器官萎縮,免疫功能低下。當(dāng)灌胃薏苡仁多糖后,給藥各劑量組的小鼠脾臟指數(shù)均極顯著高于模型組水平(p<0.01),并恢復(fù)甚至高于正常水平,其效果呈量效關(guān)系,提示薏苡仁多糖能明顯恢復(fù)并促進(jìn)小鼠的脾臟發(fā)育,增強(qiáng)免疫能力。胸腺指數(shù)結(jié)果顯示:高、中劑量組的小鼠胸腺指數(shù)(0.21±0.02)、(0.17±0.02)極顯著高于模型組(p<0.01),且高劑量組的胸腺指數(shù)極顯著高于正常組的(p<0.01),中劑量組與正常組無差異,說明小鼠經(jīng)薏苡仁多糖灌胃后,能有效恢復(fù)胸腺器官的發(fā)育。2.2薏養(yǎng)殖小鼠免疫功能的變化由表2可知,薏苡仁多糖具有明顯增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能,顯著提高小鼠脾臟淋巴細(xì)胞對刀豆蛋白(ConA)的增殖反應(yīng),并呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明:腹腔注射環(huán)磷酰胺后,模型組小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率僅(0.99±1.4)%,極顯著低于正常小鼠(1.63±0.06)%的水平(p<0.01),說明模型組小鼠的免疫功能低下。給予不同劑量的薏苡仁多糖后,可明顯刺激脾臟淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng),其轉(zhuǎn)化率隨薏苡仁多糖劑量的增加而呈極顯著上升(p<0.01),1000mg/(kgbwd)組的轉(zhuǎn)化率[(2.17±0.18)%]甚至極顯著高于正常組,提示薏苡仁多糖能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞和體液的免疫應(yīng)答。與正常小鼠相比,模型組小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)下降明顯,從正常水平的(1.4±0.90)降低為(1.02±0.00)(p<0.05);而薏苡仁多糖各劑量組的小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)均較模型組顯著提高(p<0.05,p<0.01),其中低劑量組的小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)與正常鼠的相當(dāng),而中、高劑量組明顯高于正常鼠,表明薏苡仁多糖能有效增強(qiáng)小鼠的非特異性免疫功能。2.3中央層面2.714.97,2.34.535.335.325.325.325.325.325.325.325.325.335.335.325.335.335.325.325.325.335.335.335.335.335.335.335.325.335.335.325.325.335.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.325.32由表3可知,用2%綿羊紅細(xì)胞免疫后,模型小鼠的半數(shù)溶血值、抗體生成細(xì)胞水平顯著低于正常鼠(p<0.01),由正常鼠的(117.74±4.67),(0.590±0.03)分別下降為(63.4±4.58),(0.224±0.025)。與模型組相比,薏苡仁多糖3個(gè)劑量均極顯著地促進(jìn)免疫抑制小鼠血清溶血素和抗體細(xì)胞的生成(p<0.01),并以量效效應(yīng)關(guān)系分別恢復(fù)至正常小鼠的64%~90%和55%~90%,提示薏苡仁多糖對抑制小鼠體液免疫能力的恢復(fù)具有顯著的促進(jìn)效果。3薏養(yǎng)殖多糖對金魚細(xì)胞免疫抑制的影響采用環(huán)磷酰胺建立的免疫抑制模型小鼠,以250,500,1000mg/(kgbwd)為低、中、高劑量的薏苡仁多糖灌胃28d進(jìn)行免疫功能試驗(yàn),結(jié)果顯示:1)薏苡仁多糖可修復(fù)模型組小鼠脾臟和胸腺的免疫損傷,其中,中、高劑量給藥組小鼠的脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)極顯著高于模型組(p<0.01),高劑量給藥組小鼠的兩指標(biāo)值極顯著高于正常組(p<0.01)。2)薏苡仁多糖有效激活巨噬細(xì)胞的吞噬功能,促進(jìn)刀豆蛋白誘生的淋巴細(xì)胞增殖。薏苡仁多糖各劑量組小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率與腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)均較模型組極顯著提高(p<0.01),其中,中、高劑量組均明顯高于正常鼠(p<0.01)。3)薏苡仁多糖可提高綿羊紅細(xì)胞致敏小鼠血清溶血素含量和抗體生成細(xì)胞水平(p<0.01),各劑量組小鼠的兩指標(biāo)值分別恢復(fù)至正常小鼠的64%~90%和55%~90%。薏苡仁多糖是一種天然免疫促進(jìn)劑,對環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫抑制模型有良好的拮抗作用,呈現(xiàn)良好的量-效依賴關(guān)系。薏苡仁多糖的免疫促進(jìn)作用機(jī)制可能是通過同時(shí)增強(qiáng)小鼠體液免疫、細(xì)胞免疫、非特異性免疫功能來共同實(shí)現(xiàn)。4薏養(yǎng)殖病毒的免疫作用研究免疫調(diào)節(jié)在機(jī)體中發(fā)揮著重要的作用。1974年Jerne提出著名的免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)(ImmuneNetworkTheory),其認(rèn)為免疫調(diào)節(jié)是由各種免疫細(xì)胞與免疫分子相互作用構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),即細(xì)胞免疫、體液免疫和非特異性免疫共同構(gòu)成機(jī)體的防御體系。淋巴細(xì)胞(lymphocyte)是構(gòu)成免疫系統(tǒng)的基本單位,在機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答過程中分別起著關(guān)鍵的作用。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能的強(qiáng)度。巨噬細(xì)胞是除淋巴細(xì)胞外免疫系統(tǒng)中第二大主要的細(xì)胞群,在宿主的防御機(jī)制中起關(guān)鍵性的作用。巨噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的標(biāo)志之一。巨噬細(xì)胞在某些刺激因子的誘導(dǎo)下,可轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨木奘杉?xì)胞,賦予其具有強(qiáng)大的殺傷微生物感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的能力。血清血溶素和抗體生成細(xì)胞體現(xiàn)體液免疫功能的強(qiáng)度。環(huán)磷酰胺作為一種廣譜的抗癌藥物,在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)損傷正常細(xì)胞,尤其是對機(jī)體的免疫系統(tǒng)造成損害。本試驗(yàn)中,針對采用環(huán)磷酰胺建立的免疫抑制模型小鼠,以不同劑量的薏苡仁多糖進(jìn)行灌胃治療。試驗(yàn)結(jié)果顯示,薏苡仁多糖對環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫抑制模型有良好的拮抗作用,可修復(fù)脾臟和胸腺的免疫損傷,激活巨噬細(xì)胞的吞噬功能,促進(jìn)刀豆蛋白誘生的淋巴細(xì)胞增殖,并