原發(fā)性舍格倫綜合征患者lr7、8、9表達及l(fā)r7、9在腮腺組織中的表達

原發(fā)性舍格倫綜合征患者lr7、8、9表達及l(fā)r7、9在腮腺組織中的表達

shjgreen’ssyndrose，簡稱sjsyndrose，是一種自身免疫性疾病，其特點是外源性腺體的破壞，口腔粘膜和眼睛粘膜干燥，并伴有各種自身免疫性疾病?？煞譃樵l(fā)性舍格倫綜合征(primarySj觟gren’ssyndrome,pSS)和繼發(fā)性SS(secondarySj觟gren’ssyndrome,sSS)。病變局限于淚腺和唾液腺者,稱為pSS;同時伴有其他自身免疫性疾病如類風濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等,則稱為繼發(fā)性SS。在自身免疫性疾病中,pSS的發(fā)病率僅次于類風濕性關(guān)節(jié)炎,其在正常人群中的發(fā)病率為0.6%,男女之比為1∶9,好發(fā)于中老年女性。與其他自身免疫疾病如類風濕關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡相比,舍格倫綜合征是一個進展緩慢,預后較好的疾病。但SS最常見的癥狀口干和眼干嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。類似于其他自身免疫性疾病,SS的病因尚不明確。研究認為,病毒、激素、遺傳和環(huán)境因素與SS的發(fā)病和進展有關(guān)。一些病毒如Epstein-Barr病毒、柯薩奇病毒、丙型肝炎病毒、巨細胞病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒等都被認為可能是SS的誘因。小唇腺的基因芯片研究顯示,干擾素誘導基因如Toll-likereceptor(TLR)家族,干擾素誘導跨膜蛋白家族的3個成員IFITM1、IFITM2和IFITM3,干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF1)、干擾素刺激轉(zhuǎn)錄因子3γ(ISGF3G)(也稱為IRF9)和干擾素α誘導蛋白27(I-FI27)等在pSS中顯著高表達。由于TLRs在先天性免疫和獲得性免疫應答中都是一個重要的調(diào)節(jié)因子,所以TLR家族成員在免疫科學領域是一個研究熱點。TLRs在宿主和病原微生物的接觸面發(fā)揮作用,作為人類第一道防御監(jiān)視系統(tǒng),能在第一時間抵抗病原物的侵襲。TLRs能發(fā)現(xiàn)病原相關(guān)分子模式(PAMPs),而后者是病原體的一類保守的結(jié)構(gòu)特點,被激活后即被先天性免疫系統(tǒng)識別。迄今為止,已發(fā)現(xiàn)了13種TLRs:TLR1~9系人類和小鼠共有,TLR10僅在人類發(fā)現(xiàn),TLR11~13僅在小鼠發(fā)現(xiàn)。一些TLRs(1、2、4、5和6)存在于細胞表面,而另一些TLRs(3、7、8和9)局限于細胞內(nèi)。TLR7和TLR8作為家族中最相似的成員,能識別病毒的PAMPs,TLR9能被含有非甲基化的CpG二核苷酸的病毒DNA序列激活。所以,TLR7、8和9組成了TLR家族中的一個功能亞族,它們能在內(nèi)涵體或溶酶體內(nèi)識別病毒的PAMPs。由于多種病毒被認為是pSS發(fā)病的誘因,故本研究通過使用實時多聚酶鏈反應(real-timePCR)分析pSS患者外周血中TLR7、8、9的表達水平,并對TLR7和TLR9在pSS患者腮腺組織中的表達進行了檢測。1材料和方法1.1pss的診斷研究對象來自2006年2月~2006年8月在我院口腔頜面外科涎腺專科門診就診的病例,共61例。參考2002年歐美診斷標準,其中pSS37例,對照組24例為非pSS的口干患者。pSS具體診斷標準:(1)口干癥狀;(2)眼干癥狀;(3)口干體征———方糖試驗30min內(nèi)未融化;(4)眼干體征———施墨試驗≤5mm/5min;(5)組織病理學———唇腺活檢至少有1個淋巴細胞浸潤灶;(6)血清學檢查———類風濕因子、抗SS-A、抗SS-B抗體至少1項陽性;(7)無類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病等其他自身免疫性疾病。根據(jù)以上診斷標準,將61例患者分為pSS組和對照組。pSS組37例患者以上6項中(5)、(6)均為陽性,而其余4項中2項為陽性。對照組24例患者僅有口干癥狀或腮腺腫大癥狀,而無其他任何診斷為pSS的客觀癥狀和實驗室檢查結(jié)果。對照組包括非pSS口干患者(如老年性口干、服用降血壓、安眠藥后造成的口干等)和慢性腮腺炎患者。pSS組37例,男1例,女36例;年齡21~73歲,平均(47.38±12.27)歲。對照組24例,男1例,女23例;年齡23~65歲,平均(48.13±11.32)歲。1.2免疫組化測定GeneAmpPCRSystem9700(美國ABI公司);GeneAmpPCRSystem2400(美國ABI公司);核酸蛋白質(zhì)定量系統(tǒng)DV800(美國BeckmanCoulter公司);ABIPRISM7900HT(美國ABI公司);人白血病T淋巴(Jurkat)細胞株(中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所);免疫熒光一抗TLR7:sc-30004是兔抗人的多克隆抗體(SantCruzBiotechnologyCalifornia,美國);免疫熒光二抗sc-2012是Cy3羊抗兔的IgG(SantCruzBiotechnology,California,美國);免疫組化一抗TLR9:sc-16247是兔抗人的多克隆抗體(SantCruzBiotechnology,California,美國);免疫組化二抗HRP-Polymer-Goatanti-rabbitIgG,即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司);激光共聚焦顯微鏡(LeicaTCSSP2,德國)。1.3紅細胞裂解及體外感官檢測(1)每位患者采集外周靜脈血2.5mL,以0.5mL枸櫞酸(ACD)抗凝劑(枸櫞酸0.48g、枸櫞酸鈉1.32g、右旋葡萄糖1.47g加蒸餾水至100mL)進行抗凝處理;將采集到的血液靜置約30min后,3000r/min離心2min,分離血漿。吸出血漿后,按1︰4~5的比例加入紅細胞裂解液,用漩渦振蕩器混合均勻,放于4℃環(huán)境下10min,以裂解紅細胞;2000r/min離心10min,棄上清。按每毫升全血加入1mLRIzolRNA保存液加入保存液,以備RNA抽提。(2)pSS組3例患者,對照組3例患者因藥物或保守治療無效,在患者的要求下進行腮腺淺葉切除術(shù)(pSS組為類腫瘤型SS,對照組為重度慢性阻塞性腮腺炎)。全麻下取腮腺組織,經(jīng)中性甲醛溶液固定,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,做4μm厚連續(xù)切片,備TLR7免疫熒光和TLR9免疫組化檢測。1.4實驗方法1.4.1.4離心穩(wěn)定性檢測溫育(15℃~30℃)5min,以完全分離核蛋白;加入0.2mL氯仿,劇搖15s,溫育(15℃~30℃)3min,13200r/min、4℃離心15min;將離心后的上層水相吸出,轉(zhuǎn)移到新管中,加入0.5mL異丙醇,混勻,室溫下溫育10min,13200r/min、4℃離心10min后,棄上清;在沉淀中加入1mL焦碳酸二乙酯和75%乙醇,振蕩混勻,9000r/min、4℃離心5min,棄上清;加入30μL無RNase水,吹打混勻后進行微離心;取1μL上述液體,1∶100稀釋,用核酸蛋白質(zhì)定量系統(tǒng)測該溶液的OD值,以檢驗所抽提的RNA質(zhì)量和含量。-70℃冷凍備用。1.4.2pcr反應(1)配制PCR試劑混合溶液(2)將Mix1分裝入PCR管中,每管3.5μL,加入經(jīng)過離心的RNA2.5μL,混勻,離心。用PCR儀在65℃反應5min,于冰上快速冷凍。(3)離心后,各管中再加入Mix23.5μL,混勻后離心,42℃反應2min。(4)在每管中加入0.5μL反轉(zhuǎn)錄酶,進行PCR反應。采用兩步法,反應條件如下:(5)取1mL完成反轉(zhuǎn)錄反應的溶液進行1∶100稀釋,測試OD值。1.4.3jurkat細胞濃度用全培養(yǎng)液(PRMI1640,L-谷氨酰胺,50mmol/LHEPES,100U/mL青、鏈霉素,10%胎牛血清)稀釋Jurkat細胞濃度為(1~5)×106/mL,37℃,5%CO2條件下孵育,2~3天換液1次,取對數(shù)生長期細胞,收集計數(shù)達1×107/mL。按每106~107個細胞/mLTRIzol加入試劑,并按前述方法進行總RNA抽提,反轉(zhuǎn)錄為cDNA。1.4.4引物的設計與制作具體步驟如下。(2)以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照基因,以PrimerExpress5.0軟件設計擴增模板的引物。設計的引物如下:(4)引物稀釋:引物在稀釋前,需至少離心1min,按說明書計算,以確定稀釋引物所需要加入蒸餾水的量,配成100μmol/L的儲存濃度,用前配制成10μmol/L的工作濃度。(5)引物檢測:要求引物的溶解曲線為單峰,引物無二聚體產(chǎn)生。1.4.5ct值的標化PCR反應結(jié)束后,確定基線范圍(一般為3~15個循環(huán)),分析各孔CT閾值(閾值=基線信號的標準偏差×10)。為消除每份樣品的濃度不一致與每塊板之間條件操作因素差異所形成的誤差,需要對所獲得的原始CT值進行標化。本研究用管家基因GAPDH作為內(nèi)參,1∶32稀釋jurkat細胞的IRFs表達量為標化樣品,比較各樣本表達量的高低。以SDS2.1軟件分析其Ct值。-△△Ct值=-[(樣本原始Ct值-樣本GAPDH的Ct值)-(Jurkat原始Ct值-JurkatGAPDH的Ct值)]-△△Ct值越高,表明樣本中IFN-α基因的起始模板量越大。實時定量PCR共40個循環(huán),每個循環(huán)包括95℃、10s,95℃、5s和60℃、30s。1.4.6免疫熒光二抗pbs腮腺組織切片與1∶50稀釋的抗TLR7一抗在4℃潮濕環(huán)境下孵育。然后再與免疫熒光二抗在37℃環(huán)境下孵育30min。以PBS替代一抗作為陰性對照。以細胞上出現(xiàn)紅色為陽性標記。1.4.7ntm二步法免疫組織化學檢測采用MaxVisionTM二步法,具體操作參考試劑盒工作手冊。以PBS替代一抗作為陰性對照,以細胞質(zhì)或細胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性標記。1.5統(tǒng)計處理應用SAS6.12軟件包對血細胞中的-△△Ct值進行t檢驗。P<0.05為組間有顯著性差異。2結(jié)果2.1組tlr7mrna表達量的比較37例pSS組TLR7mRNA的-△△Ct值為6.87±1.29,24例對照組TLR7mRNA為5.75±1.05(-△△Ct值越高,表明樣本中TLR7基因的起始模板量越大)。pSS組的TLR7mRNA表達量顯著高于對照組,2組之間有顯著差異,P=0.0008。pSS組TLR7是對照組的2.17倍(圖1A、圖2)。2.2組tlr8mrna表達量的比較37例pSS組TLR8mRNA的-△△Ct值為8.62±1.89,24例對照組TLR8mRNA為9.18±1.46。2組的TLR8mRNA表達量無顯著差異,P=0.223。pSS組TLR8是對照組的0.68倍(圖1B、圖2)。2.3tlr9mrna表達量37例pSS組TLR9mRNA的-△△Ct值為7.60±1.69,24例對照組TLR9mRNA為6.38±1.42。pSS組的TLR9mRNA表達量顯著高于對照組,2組之間有顯著差異,P=0.0047。pSS組TLR9是對照組的2.33倍(圖1C、圖2)。2.4tlr7在腺泡細胞中的表達免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),pSS組3例患者TLR7陽性表達的細胞位于導管上皮細胞、淋巴細胞和上皮島(圖3A~D)。對照組3例TLR7陽性表達的細胞局限于導管上皮細胞,淋巴細胞為陰性表達(圖3E)。TLR7在2組腺泡細胞中的表達均為陰性。pSS組與對照組的最大差別是SS組淋巴細胞陽性表達和上皮島陽性表達。由于上皮島是pSS組織病理學的一個特征,所以兩者間的關(guān)系有待于進一步研究。2.5tlr9在腺泡細胞表達免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),pSS組3例患者TLR9陽性表達的細胞位于導管上皮細胞、淋巴細胞和上皮島(圖4A~D)。對照組3例TLR9陽性表達的細胞局限于導管上皮細胞,淋巴細胞為陰性表達(圖4E)。TLR9在2組腺泡細胞中的表達均為陰性。與TLR7一樣,pSS組與對照組的最大差別是pSS組淋巴細胞陽性表達和上皮島陽性表達。3tlr3、7,8和9在pss和h-的表達方面的作用,主要表現(xiàn)為TLR表達于多種細胞,如呼吸道和消化道上皮細胞、B細胞、肥大細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞(DCs)、調(diào)節(jié)T細胞、巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞和內(nèi)皮細胞。TLR表達于多種細胞,證實其在先天性和獲得性免疫應答中的重要作用。TLR的一個顯著特征是對分子序列和化學結(jié)構(gòu)多樣性和專一性的識別。研究發(fā)現(xiàn),樹突狀細胞在pSS發(fā)病中具有重要作用。通過TLR受體激活漿細胞樣樹突狀細胞,將先天性免疫和獲得性免疫連接起來,誘導I型IFN(IFN-α/IFN-β)分泌顯著增多。而在血液中,I型干擾素主要來源于漿細胞樣樹突狀細胞,這類細胞被激活后能產(chǎn)生大量I型干擾素,激發(fā)先天性和獲得性免疫應答的發(fā)生。在pSS,血液中的漿細胞樣樹突狀細胞的相對數(shù)量顯著下降,而剩余的漿細胞樣樹突狀細胞仍能被激活,并產(chǎn)生大量的I型干擾素。通過TLR激活,導致漿細胞樣樹突狀細胞分泌IFN-α,主要是由于病毒感染。多種TLRs能識別病毒的組成部分,包括TLR3、7、8和9。漿細胞樣樹突狀細胞強烈表達TLR7和TLR9,如被TLR7配體、單鏈病毒RNA和一些TLR9的激活物(如DNA病毒和含有磷酸胞苷酰CpG的寡核苷酸)激活,能產(chǎn)生大量的IFN-α。漿細胞樣樹突狀細胞分泌大量的IFN-α,而漿細胞樣樹突狀細胞又主要表達TLR7和9,這從另一方面說明TLR7和9的配體是體內(nèi)IFN-α產(chǎn)生的主要誘導劑。各種不同類型細胞在應對外界刺激,包括細菌、異物、大分子、其他化學合成物和病毒等時產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì),稱為干擾素(IFN)。病毒感染在IFN產(chǎn)生的初期起著重要作用,但在組織水平的持續(xù)的IFN-α合成,需要含有RNA的免疫復合物激活漿細胞樣樹突狀細胞,產(chǎn)生IFN-α。I型IFN能召集其他免疫細胞,通過I型干擾素的各種免疫功能維持免疫應答。漿細胞樣樹突狀細胞產(chǎn)生的IFN-α能召集其他活化的細胞進入pSS的目標臟器,提示TLR7或TLR9可能在pSS發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用。除識別病原體外,TLRs也能識別宿主壞死組織釋放的自身抗原。SS的特征是淋巴細胞浸潤外分泌腺,導致外分泌腺功能受損,臨床表現(xiàn)為口干和干燥性角結(jié)膜炎。淋巴細胞浸潤灶中的細胞大多數(shù)是T淋巴細胞,B淋巴細胞占20%~30%,巨噬細胞較少。大約70%的T細