糖尿病腎病小鼠模型的構建

糖尿病腎病小鼠模型的構建

糖尿病性腎衰竭（dn）是糖尿病最常見、最嚴重的慢性微血管并發(fā)癥之一，嚴重影響了患者的生存和預后。1型糖尿病(T1DM)患者的糖尿病腎病的發(fā)生率較2型糖尿病(T2MD)高,約為30%~40%。腎小球硬化和間質纖維化是糖尿病腎病腎臟的主要病理變化。如何延緩或防治腎小球硬化,改善糖尿病患者的腎功能,對防止1型糖尿病導致的腎臟損害具有重要意義。自發(fā)性糖尿病動物模型應用價值比較高,但因其價格昂貴,飼養(yǎng)、繁殖條件要求嚴格而很難得到廣泛應用。誘發(fā)性模型成本比較低,操作方便,應用比較廣泛。常用的的方法主要是化學藥物誘導、高糖高脂飲食誘導以及化學藥物和高脂飲食聯(lián)合誘導。其中,鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)是應用地最為廣泛的化學藥物之一,它特異性作用于胰島β細胞,導致機體血糖水平升高,同時伴隨炎癥因子的表達,最終引起胰島β細胞的破壞。本實驗擬采用STZ誘導構建1型糖尿病腎病動物模型,為下一步進行糖尿病腎病實驗研究提供動物模型。1材料和方法1.1性別scxk6周齡C57BL/6小鼠,清潔級,雄性,體重20g~25g,由上海斯萊克動物公司提供[合格證號:SCXK(滬)2007-0005]。1.2特效藥1.3檸檸檬酸鈉fw,b液的配制0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液的配制:檸檬酸(FW:210.14)2.1g加入雙蒸水100mL中配成A液;檸檬酸鈉(FW:294.10)2.94g加入雙蒸水100mL中配成B液。鏈脲佐菌素(STZ)配制液:STZ易溶于水和弱酸性溶液,不穩(wěn)定,可分解為氣體,需現(xiàn)用現(xiàn)配,而且要放在-20℃低溫下避光保存待用。平時粉末狀的STZ儲存時也應保持干燥、低溫和避光。用時將檸檬酸緩沖液A、B液按1:1比例混合,酸度計測定pH值=4.2。1.4bt2c2s儀器系統(tǒng)三諾安穩(wěn)血糖儀購買自長沙三諾生物傳感技術股份有限公司,BT2202S電子分析天平購買自北京塞多利斯(Sartorius)儀器系統(tǒng)有限公司。1.5方法1.5.1小鼠的飼養(yǎng)及消毒在動物飼養(yǎng)觀察室適應性喂養(yǎng)7天,待小鼠狀態(tài)穩(wěn)定適應環(huán)境后,進入SPF級動物房。實驗期間,小鼠在層流室中分籠飼養(yǎng),所有器具及食物均消毒,嚴格執(zhí)行無菌操作原則。小鼠自由攝食,飲水自由,室溫保持在22℃~24℃,相對濕度50%~60%,12h(8:00~20:00)交替照明,保持墊料干燥,避免潮濕。1.5.2模型構建與診斷小鼠隨機分為DN模型組(簡稱Dia組)和正常對照組(簡稱Con組),每組各5只。Dia組小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ),每只70mg/kg,隔日注射,共3次;對照組給予等體積的檸檬酸鈉緩沖液注射。小鼠在同一動物房內繼續(xù)分籠飼養(yǎng),標準飲食,于STZ處理結束后的第6天、第7天、第8天及第9天分別進行尾靜脈取血測隨機血糖。若Dia組小鼠血糖值連續(xù)3天≥16.67mmol/L,則認為1型糖尿病小鼠模型構建成功。繼續(xù)自由飲食飲水,喂養(yǎng)3個月,期間不給予任何藥物干涉,每2周檢測各組小鼠的空腹血糖(禁食12h,不禁水)和體重。3個月后測定留取24h尿液進行尿蛋白測定,若Dia組明顯高于Con組,則認為1型糖尿病腎病模型構建成功。糖尿病診斷標準參考《內科學》五年制教材第6版。當隨機血糖≥11.1mmol/L(WHO,1999年)且24h尿蛋白排泄量與對照組小鼠無顯著差異時,認為代表糖尿病階段;當持續(xù)高血糖且24h尿蛋白排泄量顯著高于對照組小鼠時,認為代表糖尿病腎病階段。1.5.3腎組織病理學檢測DN動物造模成功后,處死并取材。處死前禁食12h,稱體重(BW)。2%戊巴比妥鈉40mg/kg進行腹腔注射麻醉,眼皉靜脈取血,測量空腹血糖;沿腹中線逐層切開皮膚、肌肉及腹膜,取出兩側腎臟,清除腎門處的血管脂肪等組織,稱質量(KW)。每個腎臟分別從中線剖開,其中一側腎臟組織的1/2用4%甲醛固定,用于后續(xù)的病理學觀察及免疫組織化學檢測,其余腎臟組織-80℃冰箱保存用于相關的指標檢測。1.5.4腎指標和體重、腎功能指數(shù)化學指標一般情況的觀察:觀察小鼠的飲食、飲水量、大小便、體毛色澤、精神狀態(tài)和活動情況等。體重(BW)和腎質量(KW)使用電子分析天平測量;24h尿蛋白(MAU)采用Thshiba-120FR全自動生化分析儀進行檢測;血糖(Glu)采用血糖儀進行監(jiān)測。1.6統(tǒng)計學分析實驗所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,用統(tǒng)計學軟件SPSS12.0、MicrosoftOfficeExcel2003分析,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。2結果2.1鼠形態(tài)和月際本次實驗Dia組小鼠成模率為100%。Con組小鼠形態(tài)適中,活潑健壯,每日飲水量、尿量正常,毛色光滑柔順。Dia組小鼠精神萎靡,多飲(約為對照組的2倍)、多食、多尿、毛發(fā)灰暗欠光澤。2.2小鼠血糖測定結果分別于注射STZ結束后的第6天、第7天、第8天及第9天進行尾靜脈采血測隨機血糖。結果顯示:Con組小鼠的血糖值在12.6mmol/L左右,Dia組小鼠血糖值連續(xù)3天≥16.67mmol/L。表明1型糖尿病小鼠模型構建成功(見表1)。2.3平均血糖的變化分別在注射后的第2、4、6、8、10、12周對兩組小鼠進行尾靜脈采血,血糖儀測定空腹血糖。結果顯示:Con組小鼠的血糖始終處于小鼠血糖正常范圍內,而Dia組小鼠的血糖值始終處于模型要求的標準之上。在注射STZ后的第2周,Dia組小鼠平均血糖水平達到12.88±0.397mmol/L,與對照組(6.36±0.185mmol/L)相比存在顯著性差異(P<0.001)。而且隨著注射后的第4、6、8、10、12周,Dia組小鼠的平均血糖水平也隨之上升,在第12周時,Dia組小鼠平均血糖水平已高達22.58±0.611mmol/L,顯著高于對照組(P<0.001)(見表2、圖1)。2.4小鼠體重和周齡的變化造模前兩組間體重差異無顯著性,造模后Con組小鼠的體重隨周齡的增加而明顯增加,而Dia組小鼠體重隨周齡的增加變化不明顯。注射STZ后第12周時,解剖小鼠,分別稱取兩組小鼠的腎臟組織,結果顯示:Dia組小鼠的腎臟質量指數(shù)(KW/BW)明顯高于Con組(P<0.001)(見圖2)。2.5h尿蛋白檢測注射STZ后第12周時,在代謝籠中分別留取各組小鼠24h尿液,混合均勻,測定24h尿蛋白。結果顯示:Dia組小鼠的24h尿蛋白顯著高于Con組(P<0.01)(見圖3)。表明1型糖尿病腎病動物造模成功。3對胰島細胞的損害作用糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)主要的微血管并發(fā)癥之一,己成為導致終末期腎臟疾病(endstagerenaldisease,ESRD)的重要因素,同時也是糖尿病患者死亡的主要原因。DN的發(fā)病機制比較復雜,至今仍未完全闡明。因此,建立并提供穩(wěn)定可靠的理想糖尿病腎病動物模型成為研究該疾病發(fā)病機制的重要前提。鏈脲佐菌素(STZ)是一種含亞硝基化合物,是由無色素原鏈霉菌屬所產(chǎn)生的廣譜抗生素,具有抗腫瘤的作用,其副作用是導致糖尿病。STZ進入體內可通過以下幾個方面特異性地破壞胰島β細胞:(1)STZ經(jīng)由葡萄糖轉運體進入胰島β細胞內,導致DNA烷基化,造成DNA損傷,進而使多聚ADP核糖發(fā)生基化作用,最終導致胰島β細胞變性壞死;(2)STZ破壞胰島β細胞后,激活自身免疫過程,體內免疫細胞攻擊損傷的胰島β細胞;(3)通過自由基和氧化亞氮兩種途徑損傷胰島β細胞的DNA,進一步誘導多聚ADP核糖發(fā)生基化作用,導致大量胰島β細胞壞死?？傊?STZ特異性作用于胰島β細胞,達到一系列病理學形態(tài)的變化。通過電鏡觀察我們發(fā)現(xiàn),STZ損傷胰島β細胞及其相關細胞器的膜結構,引起酶活性的改變并促使酶從細胞內擴散出來,導致胰島β細胞功能的喪失。一般STZ誘導的糖尿病類型可因給藥劑量的不同而有所差別,一次性大劑量STZ(HighDoseSTZ,HD-STZ)誘導的模型與急性型T1DM的癥狀比較相似,而多次小劑量STZ(MultiplelowdoseSTZ,MLD-STZ)則用來誘導慢性型T1DM。T1DM是由一種T淋巴細胞介導的多基因、多病因的自身免疫性疾病。它是在遺傳易感基因的基礎上,通過環(huán)境因素的誘導作用,引發(fā)由T淋巴細胞介導的特異性的自身免疫反應,并導致胰島β細胞大量損傷和破壞,引起胰島素的絕對缺乏,失去其對血糖的調控作用,導致血糖水平逐漸上升。目前研究發(fā)現(xiàn),MLD-STZ誘導T1DM小鼠模型的致病機制類似于人類的T1DM,因此成為研究T1DM的常用模型。HisafumiYasuda等應用MLD-STZ(40mg/kg,連續(xù)5天)誘導雄性昆明鼠進行研究,當小鼠血糖連續(xù)3周高