鏈脲佐菌素與四氧啶誘導(dǎo)兔1型糖尿病模型效果比較

鏈脲佐菌素與四氧啶誘導(dǎo)兔1型糖尿病模型效果比較

糖尿病已成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三類非傳染性疾病。現(xiàn)在，它被認(rèn)為是細(xì)胞缺陷和缺乏的基本病理特征。隨著細(xì)胞移植和組織工程研究的不斷發(fā)展,細(xì)胞替代療法優(yōu)勢凸現(xiàn),但仍需大量的深入研究,因而,建立可進(jìn)行細(xì)胞移植的大型糖尿病動(dòng)物模型尤為關(guān)鍵。國內(nèi)廣泛使用的大鼠糖尿病模型很難滿足細(xì)胞移植研究的需要,因此本試驗(yàn)采用鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)與四氧嘧啶(Alloxan,ALX)作為誘導(dǎo)劑,分別通過靜脈注射和腹腔注射途徑誘導(dǎo)新西蘭大白兔1型糖尿病模型,通過比較其建模影響因素、成模效果及穩(wěn)定性,確立了建立穩(wěn)定、理想的兔糖尿病模型的方法。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心3月齡雄性新西蘭大白兔25只,體重(2.0±0.1)Kg/只,購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。喂養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房,飼喂通用顆粒飼料,室內(nèi)通風(fēng)良好,相對濕度為40%-70%,室溫15-20℃,試驗(yàn)前適應(yīng)性預(yù)飼養(yǎng)1周。1.2氧吡啶siga鏈脲佐菌素(500mgSigma),四氧嘧啶(5gSigma),長效胰島素(10ml∶400IU,江蘇萬邦H32024565),美國強(qiáng)生穩(wěn)豪血糖儀。1.3給藥及數(shù)學(xué)模型的建立1.3.1藥物配制檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液的配制:將0.1M檸檬酸溶液與0.1M檸檬酸鈉溶液以1.6∶1的比例混合,制成PH=4.2的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液200ml備用。STZ溶液的配制:稱取STZ1200mg加入新鮮配制的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液120ml內(nèi),充分溶解,過濾消毒,制成濃度為10mg/ml的STZ溶液。ALX溶液的配制:稱取ALX3750mg,加入0.9%的生理鹽水75ml充分溶解,過濾消毒,制成濃度為50mg/ml的ALX溶液。1.3.2動(dòng)物分組新西蘭白兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,建模前禁食水4小時(shí),稱量空腹體重,耳緣靜脈取血測定血糖濃度,按照建模條件的不同,隨機(jī)分為5組。A組為STZ靜脈給藥組,B組為STZ腹腔給藥組,C組為ALX靜脈給藥組,D組為ALX靜脈給藥組,E組為正常對照組,5只/組。1.3.3糖尿病模型的建立A組:根據(jù)稱量體重,按40mg/kg標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)耳緣靜脈注入新鮮STZ溶液;B組:以5ml注射器穿刺兔左上腹腔,回抽無液體后,根據(jù)稱量體重按80mg/kg標(biāo)準(zhǔn)注入新鮮STZ溶液;C組:根據(jù)稱量體重,按100mg/kg標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)耳緣靜脈注入新鮮ALX溶液;D組:以5ml注射器穿刺兔左上腹腔,回抽無液體后,根據(jù)稱量體重按200mg/kg標(biāo)準(zhǔn)注入新鮮ALX溶液;E組:不給予任何藥物誘導(dǎo)。1.3.4糖尿病相關(guān)指標(biāo)檢測及胰島素管理于注射藥物后12h、24h、48h、72h分別在兔耳緣靜脈取血,血糖儀檢測禁食4h后的血糖濃度并稱量體重,此后每3d測量血糖濃度1次。當(dāng)血糖≥12.0mmol/L且持續(xù)2周維持在此高血糖水平時(shí)判斷為建模成功。對于血糖濃度≥15.0mmol/L者,給予皮下注射長效胰島素(10-20IU/kg,1次/日),根據(jù)血糖變化調(diào)整胰島素用量,控制血糖在≤14.0mmol/L范圍。1.3.5葡萄糖耐量試驗(yàn)藥物誘導(dǎo)后7d行靜脈葡萄糖耐量試驗(yàn):每只兔經(jīng)耳緣靜脈推注10%的葡萄糖(0.5g/kg),分別于注射前1h,注射后30、60、120min取靜脈血測定血糖濃度,檢測糖尿病兔模型對葡萄糖刺激的反應(yīng)。1.3.6數(shù)據(jù)處理所測血糖濃度及體重以ˉx±sxˉ±s表示,所獲數(shù)據(jù)以SPSS10.0軟件進(jìn)行分析。2結(jié)果2.1前兔在不同血糖濃度下的急性毒性試驗(yàn)對建模試驗(yàn)組進(jìn)行不同給藥處理后,與對照組相比,可觀察到多數(shù)試驗(yàn)兔在24-48小時(shí)后出現(xiàn)委靡、食欲減退、皮毛松散等癥狀,其癥狀隨血糖濃度高低而波動(dòng),3d后開始出現(xiàn)多飲、多食、多尿,6d后各試驗(yàn)組兔的體重較給藥前均有不同程度減輕(0.2-0.6kg)。ALX靜脈給藥組于給藥后第3d死亡1只,其余均存活。2.2不同給藥方式對血糖運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)結(jié)果兔的血糖濃度及體重在給藥前后的變化見表1:建模后試驗(yàn)組大白兔的血糖濃度較建模前及對照組均明顯升高,體重均較建模前及對照組降低,兩種藥物對糖尿病兔的血糖濃度均有顯著影響(P<0.05),但在相同給藥方式下,鏈脲佐菌素的誘導(dǎo)作用明顯弱于四氧嘧啶,且經(jīng)靜脈給藥組的血糖濃度明顯高于腹腔給藥組。兩種不同藥物在不同給藥方式下血糖濃度平均數(shù)的波動(dòng)變化見圖1:A、C、D三組試驗(yàn)動(dòng)物于給藥后12-24h血糖濃度開始逐漸升高,其中C組平均血糖濃度最高,有4/5只試驗(yàn)兔的血糖值≥28.0mmol/L,然后逐漸下降,至72h后血糖值保持相對穩(wěn)定(A組平均血糖濃度:11.4mmol/L,C組平均血糖濃度:26.8mmol/L,D組平均血糖濃度:12.6mmol/L);B組試驗(yàn)動(dòng)物血糖濃度于給藥后48h開始出現(xiàn)升高,但升高幅度小于其他試驗(yàn)組且無明顯波動(dòng),至給藥后6d血糖濃度趨于穩(wěn)定(平均血糖濃度:10.3mmol/L)。對C組試驗(yàn)兔給予皮下注射長效胰島素(初始劑量10IU/kg,1次/日),3d后增加至20IU/kg、1次/日,血糖最終控制在≤14.0mmol/L范圍。2.3葡萄糖抗量試驗(yàn)給藥后7d,對各試驗(yàn)組糖尿病兔行靜脈葡萄糖耐量試驗(yàn),與對照組相比,各試驗(yàn)組糖尿病兔對葡萄糖刺激的反應(yīng)不同程度減弱,其中C組最為明顯。3給藥劑量及給藥方式對實(shí)驗(yàn)兔的影響既往糖尿病動(dòng)物模型的研究過多集中于大鼠,我們必須建立一種相對大型的糖尿病動(dòng)物模型,以進(jìn)行與糖尿病治療相關(guān)的藥理及移植研究。兔在給藥干預(yù)、取血、抗病性等方面明顯優(yōu)于大鼠,且體形適中,便于飼養(yǎng)和進(jìn)行細(xì)胞移植試驗(yàn),因此是一種相對比較理想的糖尿病動(dòng)物模型。目前制作實(shí)驗(yàn)性糖尿病模型的方法及途徑很多,藥物誘導(dǎo)法以其簡便易行、并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用,鏈脲佐菌素和四氧嘧啶則是其中最為常用的兩種誘導(dǎo)建模藥物。四氧嘧啶能選擇性破壞胰腺β細(xì)胞,使胰島素分泌功能喪失,造成內(nèi)分泌功能紊亂,使糖、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)代謝失調(diào)。在建模過程中,由于四氧嘧啶對胰島細(xì)胞的破壞作用迅速而強(qiáng)烈,建模的同時(shí)也導(dǎo)致肝、腎組織中毒性損害,從而使建模動(dòng)物死亡率較高;鏈脲佐菌素作為一種抗菌素,具有抗菌、抗腫瘤的藥效和致糖尿病的副作用,對胰腺β細(xì)胞同樣具有高度選擇性的毒性作用,但作用較為溫和,其對組織的毒性相對較小,動(dòng)物存活率較高。采用不同劑量的STZ給藥方式,可以分別誘導(dǎo)出類似人類1型和2型糖尿病表現(xiàn)的動(dòng)物模型。既往文獻(xiàn)認(rèn)為:四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病模型的建模率高于鏈脲佐菌素;我們則認(rèn)為:評價(jià)一種藥物的建模效率,應(yīng)從建模效果、安全性、可控性和成本等方面綜合評價(jià)。可查閱的四氧嘧啶腹腔給藥劑量為125-200mg/kg,鏈脲佐菌素則為65-80mg/kg,本試驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)采用了兩種藥物的腹腔注射上限劑量,靜脈給藥則為腹腔注射濃度的1/2。試驗(yàn)結(jié)果表明:無論經(jīng)靜脈給藥還是腹腔注射給藥,四氧嘧啶組試驗(yàn)動(dòng)物的血糖濃度上升均較鏈脲佐菌素組迅速且幅度更大。但靜脈給藥條件下,四氧嘧啶組試驗(yàn)兔的血藥濃度高達(dá)正常值的5倍,經(jīng)胰島素管理后(最大胰島素用量達(dá)40IU/只)血糖濃度才穩(wěn)定于理想范圍,且模型動(dòng)物的死亡率高于鏈脲佐菌素組,其原因可能在于四氧嘧啶使用劑量明顯高于鏈脲佐菌素,直接入血后對胰腺損傷較大而加快了糖、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的代謝失調(diào),這就造成了建模白鼠的體重快速下降和死亡率增加,故在靜脈給藥條件下我們建議采用較為合理安全鏈脲佐菌素作為誘導(dǎo)劑;而在腹腔注射條件下,四氧嘧啶組試驗(yàn)兔的血糖濃度升高平穩(wěn),在7d內(nèi)血糖可達(dá)到糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)并保持穩(wěn)定,鏈脲佐菌素組試驗(yàn)兔的血糖則上升緩慢,低血糖