大腸癌患者腸道菌群的變化

大腸癌患者腸道菌群的變化

通過對直腸菌群與正常人口之間常見腸道細(xì)菌的比較，作者選擇了兩種具有代表性的需氧和選擇性細(xì)菌。三種具有代表性的厭氧菌（曲線菌）、雙殼菌和乳酸桿菌進(jìn)行了定量和定量比較，探討了腺瘤患者和正常腸菌群之間的差異，并為制定和治療結(jié)腸癌等新方法提供了新思路。為2009年1月至2009年8月行大腸癌鏡檢取材、病理證實患者30例,其中男16例,女14例,年齡52~72歲,平均62歲;正常人群對照組30例,年齡45~69歲,平均52歲.所選病例為正常人群、大腸癌確診患者且手術(shù)前未做內(nèi)腸道準(zhǔn)備,晨起排便,且所有患者在采樣前1月均未用過抗生素、微生態(tài)活菌制劑及聚乙二醇等導(dǎo)瀉劑.正常人群采樣前無消化道疾病、腹瀉及肝膽胰疾病史,亦無以上藥物使用史.1.2kv培養(yǎng)基(1)培養(yǎng)基:(1)厭氧培養(yǎng)基:TPY培養(yǎng)基,MRSA培養(yǎng)基,KV培養(yǎng)基;(2)需氧培養(yǎng)基:EMB培養(yǎng)基,PZ培養(yǎng)基.(2)儀器和設(shè)備:Ⅱ級生物安全柜、37℃普通培養(yǎng)箱、MicroScanWalkAway-40鑒定與藥敏測試系統(tǒng).1.3菌株的培養(yǎng)和接種取適量新鮮糞便,30min內(nèi)送檢.稱取0.1g的糞便于EP管中,加入0.9mL生理鹽水,系列倍比稀釋,各稀釋度取0.05mL用接種環(huán)分別接種至選擇性培養(yǎng)基平板上,進(jìn)行初次分離培養(yǎng).需氧菌37℃培養(yǎng)18~24h,厭氧菌37.5℃厭氧培養(yǎng)24~48h,如無菌生長,繼續(xù)培養(yǎng)至1周.然后對厭氧菌挑取少許菌落做二次傳代厭氧培養(yǎng).最后分別對各菌株進(jìn)行鑒定并按平板活菌計數(shù)法計數(shù).菌群平板活菌計數(shù)法:根據(jù)平板菌落計數(shù)和稀釋度,每克標(biāo)本中活菌集落單位計算公式:結(jié)果以每克糞便量中菌落形成單位的對數(shù)值表示.接種前,涂片觀察菌株的純度、革蘭氏染色反應(yīng)和菌落形態(tài).然后將菌株接種入3mL接種液(經(jīng)高壓消毒的去離子水),制成至少相當(dāng)于McFarland3標(biāo)準(zhǔn)液但不高于McFarland5標(biāo)準(zhǔn)液的渾濁懸濁液.接著,按不同要求向鑒定板每個含有底物的孔和兩個對照孔中加入50μL細(xì)菌懸液.然后將已接種的鑒定板在MicroScanWalkAway-40鑒定與藥敏測試系統(tǒng)中,35℃~37℃的條件下孵育4h.讀取鑒定板,記錄所有底物的結(jié)果,并與相應(yīng)細(xì)菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比.1.5統(tǒng)計方法進(jìn)行SPSS統(tǒng)計分析,文中計量資料采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.2各組大腸桿菌、糞腸霉菌計數(shù)比較正常人對照組與大腸癌患者組比較結(jié)果:大腸癌患者組大腸桿菌、糞腸球菌計數(shù)顯著增加;雙岐桿菌,乳酸桿菌、類桿菌(彎曲桿菌)計數(shù)顯著減少.根據(jù)文獻(xiàn)報道,菌群失調(diào)按標(biāo)準(zhǔn)判定為:Ⅲ度菌群失調(diào),見表1.3腸道菌群的確定現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),人體腸道中,厭氧菌都比需氧菌在數(shù)量上多得多.過去認(rèn)為糞便中含有大量的大腸桿菌(需氧菌),現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)糞便中厭氧菌比需氧菌多1000~10000倍.1957年,“厭氧菌占絕對優(yōu)勢”的概念建立.在結(jié)腸中厭氧菌:需氧菌比例是3000:1,人們攜帶巨大數(shù)量的細(xì)菌(尤其是厭氧菌)對健康當(dāng)然有好的作用,也會有壞的作用,一般正常情況下還是以好的有益作用為主,只在人體異常情況下才發(fā)生致病作用.有學(xué)者證實,不論是嬰兒還是成人,腸道中均以厭氧菌主要是雙歧桿菌和類桿菌占絕對優(yōu)勢(95%以上),而需氧菌或兼性厭氧菌,如大腸桿菌、腸球菌等總數(shù)相加也不超過5%.本研究所使用稀釋性平板活菌計數(shù)法,不是所有稀釋度都要進(jìn)行接種,而是只選擇易計數(shù)的稀釋度進(jìn)行接種.通過對培養(yǎng)結(jié)果的多次觀察和分析,得出經(jīng)驗:在10-1、10-2、10-3這3個稀釋度進(jìn)行接種后菌落生長得比較密集,很難計數(shù);而在10-7、10-8、10-9這3個稀釋度進(jìn)行接種后幾乎不長任何菌落.所以,培養(yǎng)雙歧桿菌、乳酸桿菌和類桿菌可以選擇10-4、10-5、10-6個稀釋度進(jìn)行接種,培養(yǎng)大腸桿菌可以選擇10-3、10-4個稀釋度進(jìn)行接種,培養(yǎng)腸球菌可以選擇10-4、l0-5稀釋度進(jìn)行接種.這次研究對腸道菌群進(jìn)行了定性、定量分析,在獲得腸道菌群正常參考值的同時,也發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長,老年人腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌、類桿菌等厭氧菌數(shù)量明顯減少,腸桿菌和腸球菌數(shù)量明顯增加.這一分析結(jié)果充分反映了腸道的定植抗力,說明老年人的腸道對病原菌的抗力降低,易引起疾病.而且,隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展,大腸癌發(fā)病率的逐年升高.目前已證明大腸癌與飲食習(xí)慣導(dǎo)致的腸道內(nèi)環(huán)境改變密切相關(guān),而腸道菌群又是構(gòu)成腸道內(nèi)環(huán)境的重要因素.本研究發(fā)現(xiàn)大腸癌患者大腸桿菌數(shù)量顯著增加,雙岐桿菌、乳酸桿菌、類桿菌等厭氧菌數(shù)量顯著減少,厭氧菌和需氧菌的數(shù)量比例明顯倒置.可能的原因:(1)大腸癌患者因年老腸道機(jī)能病變,腸蠕動吸收功能下降導(dǎo)致腸道內(nèi)環(huán)境改變,需氧菌數(shù)目升高,厭氧菌數(shù)目降低.(2)大腸桿菌、腸球菌顯著增加,雙岐桿菌、類桿菌、乳酸桿菌等顯著減少可能與腸道免疫功能下降有關(guān).(3)飲食習(xí)慣改變高脂肪及高蛋白食物攝入的增加導(dǎo)致腸道菌群改變與大腸癌形成及發(fā)生、發(fā)展有關(guān).(4)革蘭氏陰性桿菌中不少菌種為硝酸鹽還原酶陽性,胃腸中硝基還原酶活性的細(xì)菌使食物中的硝酸鹽和酰胺類生成亞硝酸鹽和亞硝酰胺,促進(jìn)腸道癌癥發(fā)生.所以,大腸癌的發(fā)生發(fā)展與腸道內(nèi)環(huán)境密切相關(guān),腸道菌群失調(diào)是重要的腫瘤病因?qū)W因素.因此,深入研究大腸癌腸道菌群所致腸道微生態(tài)的變化對預(yù)防大腸癌的發(fā)生有益.另外,大腸癌病人,尤其是晚期患者常合并一些并發(fā)癥,如細(xì)菌移位導(dǎo)致的感染、血液系統(tǒng)抑制導(dǎo)致的貧血、胃腸道功能消化不良、重要器官功能不全、晚期惡病質(zhì)等.所以,給圍手術(shù)期大腸癌患者補(bǔ)充纖維素和益生菌則可有效減少并發(fā)癥的發(fā)生.而且,比較圍手術(shù)期應(yīng)用4株乳酸桿菌+4種纖維素和單純給予1種纖維素對大腸癌等胃腸道腫瘤患者的效果,結(jié)果顯示前者能有效減少術(shù)后細(xì)菌感染.并且,補(bǔ)充纖維素和益生菌可有效改善腸道微生態(tài)及腸道免疫屏障,降低并發(fā)癥的發(fā)生,給手術(shù)創(chuàng)造有利的條件,延長病人生命,提高病人生活質(zhì)量.未來的微生態(tài)學(xué)治療努力將會集中在多種益生菌和合生素的聯(lián)合應(yīng)用,以及尋找迄今未被發(fā)現(xiàn)和使用的纖維素和益生菌.在各種疾病,尤其是外科圍手術(shù)期患者中應(yīng)用益生菌或合生素也是未來努力的方向.因此,加強(qiáng)對大腸癌患者腸道菌群的研究,采取積極的應(yīng)對措施,對大腸癌的防治具有重要的意義.人類消化道內(nèi)蘊(yùn)藏有約1014個活細(xì)菌,即100萬億個細(xì)菌細(xì)胞,然而人體細(xì)胞總數(shù)也不過1013個,即消化道內(nèi)細(xì)菌的總數(shù)比人體細(xì)胞總數(shù)還多10倍,其種類有100種以上.腸道中細(xì)菌與