ax亞型漢族家系abo基因序列變異分析

ax亞型漢族家系abo基因序列變異分析

abo血型是最重要的血樣系統(tǒng)，從abo血型系統(tǒng)的三個主要等位基因（a1、b、o）編碼到abo進行分類后，它首先被分解為雅馬拉喬等人的克隆序列。根據(jù)aa和b等位基因，藍色信號的物質(zhì)由5553個氨基酸組成。這是由短氮端、疏水側(cè)和左右c重環(huán)境區(qū)組成的糖基轉(zhuǎn)移酶。近來不同人種、不同個體ABO變異的等位基因被報道。在以往的研究中,我們觀察了隨機中國漢族人群ABO血型的基因,探討了中國漢族人群ABO普通血型基因的遺傳背景。在目前的工作中,我們進一步研究了中國漢族人群變異的ABO亞型。通過測序而使我們可以推測某個氨基酸對于催化區(qū)域糖基轉(zhuǎn)移酶活性特異性或水平的影響。在這個研究中,我們發(fā)現(xiàn)一個Ax血型家系的數(shù)個個體中ABO基因第七外顯子有新的點突變導致表達蛋白中氨基酸改變。對象和方法1.對象一個ABO血型為Ax的家系,先證者(家系樣本編號為3)為我單位的健康捐血者,采集的血樣本共計5份,樣本編號示圖1。2.反定型紅細胞及人源抗ab/a血型正反定型、吸收放散試驗、唾液物質(zhì)測定均按文獻方法,其中抗A、抗B血清(Ortho公司),抗A1、抗H血清(Dominion公司),反定型紅細胞及人源抗AB血清為自制。3.熱啟動技術(shù)使用G&T公司ABO基因分型試劑盒,能夠檢測A101、A102、B1、O1、O2、A2016種等位基因,內(nèi)對照為擴增人類生長激素(HCH)基因的擴增產(chǎn)物為207bp。采用熱啟動技術(shù)即95℃預溫5min,然后95℃30s,60℃30s,72℃90s進行30個循環(huán),72℃延伸5min進行擴增。PCR產(chǎn)物檢測:4.0%瓊脂糖,10V/cm電泳25min。紫外燈下確定結(jié)果。4.pcr擴增按文獻OlssonML設(shè)計的引物,mo-46:5′cggaattcactcgccactgcctgggtctc3′,mo-57:5′cgggatccatgtgggtggcaccctgcca3′;用于擴增第6外顯子252bp的片斷;mo-71:5′gggcctaggcttcagttactc3′,mol-101:5′cgggatccccgtccgcctgccttgcag3′(由上海生工所合成)用于擴增第7外顯子843bp的片斷。PCR反應體系包括:每種dNTP400μmol/L,Mg2+2.5μmol/L,10×PCRbuffer5μl,Taq酶3U,模板DNA500ng,每條引物0.1μmol/L,終反應體系50μl。PCR反應在PE9600擴增儀上進行,循環(huán)參數(shù)為:95℃10min;94℃60s,63℃90s,72℃60s,10個循環(huán);94℃60s,61℃90s,72℃60s,25個循環(huán);72℃10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)TakaraDNAFragmentPurificationKit(大連寶生物公司)純化,配成25～30μl的DNA測序模板。使用循環(huán)測序試劑盒(TheBigDyeTerminatorCycleSequencingKit,美國ABI公司)直接測序,測序引物與本研究擴增ABO基因第6、7外顯子的引物序列相一致,正、反方向通測,用ABI3100DNA測序儀檢測、SeqPOP6BDv1軟件分析結(jié)果。5.特異性序列的測定對上述4中第7外顯子的擴增產(chǎn)物,使用表1中所列的2個引物進行特異性序列的測定。測序反應的產(chǎn)物經(jīng)純化,用ABI3100測序儀檢測,SeqPOP6BDv1軟件分析結(jié)果。由于2條測序引物分別是正反向的,測得序列的5′與3′端會產(chǎn)生重疊。電泳結(jié)果及序列分析被檢家系5份血型及唾液型物質(zhì)結(jié)果見表2。標本編號為1、5的樣本定為O1O1,標本編號為2樣本定為A102A102,標本編號為3的樣本定為A102O1,樣本編號為4的樣本定為B1O1O1,4種電泳結(jié)果示于圖2。以正常A101、B101、O1等位基因序列對照,發(fā)現(xiàn)樣本編號為2、3共計2份樣本出現(xiàn)467C/T、829G/A、1009A/G雜合。出現(xiàn)的467C>T、829G>A、1009A>G突變不能確定在哪條單倍體上,對此2份樣本第7外顯子的擴增產(chǎn)物進行ASP序列分析,發(fā)現(xiàn)467T、829A、1009G突變發(fā)生在同一條單倍體基因上,這個新Ax等位基因829位、1009位序列圖譜見圖3,4。ax-7基因的突變Ax亞型是ABO血型一種較為常見的弱表現(xiàn)型,其血清學特點是紅細胞上A抗原位點數(shù)目稀少,而H抗原活性相應增強,與大多數(shù)B型人血清中抗A不發(fā)生凝集,而與大多數(shù)O型人抗AB發(fā)生凝集,血清中常含有抗A1,偶爾含有凝集A1也凝集A2的抗體,Ax分泌型唾液中會有正常H抗原,但A抗原極少,常常不能測出。本家系經(jīng)唾液中型物質(zhì)分析與血清學檢測,可以確定出現(xiàn)的弱A表現(xiàn)型為Ax。國外已報道的Ax亞型等位基因有8種,見表3。在日本,3份被檢Ax表型的個體,2份為646T>A,為ABO*Ax-1,另外1個與A102序列一致。Ax-1與A101相比,只有646位核苷酸T轉(zhuǎn)變?yōu)锳,導致了216位氨基酸由P變?yōu)镮,糖基轉(zhuǎn)移酶的活性大大降低。Ax-4與Ax-1相比,多了一個無義突變681G>A。Ax-7與A101相比,在996位核苷酸G轉(zhuǎn)變?yōu)锳,導致了332位變?yōu)榻K止密碼。Ax-8與A101參比序列相比,是在第6內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)眾多突變,內(nèi)含子的變異會影響mRNA的剪接。其余5種Ax等位基因,都是染色體上DNA重組導致雜合基因,而使得翻譯的糖基轉(zhuǎn)移酶活性也大大降低。5份Ax等位基因都含有646T>A,681G>A,771C>T,829G>A這4種變異,而這4種突變點均能在O1v中找到。Ax-2是含297A>G這個典型的B等位基因突變,文獻上把它定為B-O1v;Ax-3交換位置是在外顯子6的nt298與內(nèi)含子6nt41之間,文獻上把它定為A1-O1v;Ax-5交換位置在內(nèi)含子6中。Ax-6交換位置也在內(nèi)含子6中,但位置與Ax-5不同,文獻上均把Ax-5、Ax-6定為A1-O1v雜合。我們在這個家系中發(fā)現(xiàn)兩例(1例Ax亞型,1例A型),標本A基因含467C>T、829G>A、1009A>G突變。這3個突變將導致156位氨基酸由脯氨酸(Pro)變?yōu)榱涟彼?Leu),277位氨基酸由纈氨酸(Val)轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼?Met),337位氨基酸由精氨酸(Arg)轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼?Gly)。在A基因中,已有文獻報道過467C>T、1009A>G這兩個點突變,含這兩個突變的A基因被定為A205基因,我們以往的研究也表明在中國人群中A2亞型的分子結(jié)構(gòu)以A205占優(yōu)勢。但在A205基因的基礎(chǔ)上多了個829G>A突變,這在所有人種中未見報道,這個Ax新變異等位基因已獲Genbank的注冊號(DQ092380)。這個新基因在該家系中呈穩(wěn)定遺傳,先證者母親(樣本編號2)表現(xiàn)為A型,但經(jīng)基因分析,且其女為Ax型,可以知道其基因型為A102/Axnew。由于A205型基因中也有464C>T與1009A>G兩個突變,Ax新基因與A205基因相比,其控制的血型糖基轉(zhuǎn)移酶表達出來的A抗原血清學活性與A2糖基轉(zhuǎn)移酶相比有著極大的降低,所以可知,829位G>A突變是導致A型糖基轉(zhuǎn)移酶活性大大降低的主要原因。推測在Ax等位基因mRNA翻譯成轉(zhuǎn)移酶后,由于277位氨基酸由纈氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼岷?蛋白構(gòu)象