不同方法學(xué)檢測耳聾易感基因GJB2的對比研究-Sanger測序法與導(dǎo)流雜交技術(shù)的方法學(xué)對比

ADDINCNKISM.UserStyle不同方法學(xué)檢測耳聾易感基因GJB2的對比研究—Sanger測序法與導(dǎo)流雜交技術(shù)的方法學(xué)對比[摘要]目的：比較Sanger測序與導(dǎo)流雜交技術(shù)應(yīng)用于先天感音神經(jīng)性耳聾患者常見耳聾易感基因GJB2檢測的優(yōu)缺點(diǎn)，并探討其臨床應(yīng)用價值。方法：隨機(jī)抽取120例耳聾收檢樣本，分別采用Sanger測序與導(dǎo)流雜交技術(shù)檢測非綜合征型耳聾易感基因GJB2的突變情況，對比研究兩個方法學(xué)的檢測結(jié)果。結(jié)果：Sanger測序法的突變檢出率大于導(dǎo)流雜交技術(shù)（χ2=4.167，P=0.031）；其靈敏度低于導(dǎo)流雜交技術(shù)（χ2=15.54，P=0.001），兩者比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義。Sanger測序法的準(zhǔn)確性（100%）高于導(dǎo)流雜交技術(shù)（90%）；其耗材、耗時均多于導(dǎo)流雜交技術(shù)，且具有更大的通量。結(jié)論：在檢測中國國情的致聾基因GJB2的突變情況，Sanger測序法具有高特異性、高準(zhǔn)確性、高通量的優(yōu)點(diǎn)，更適合罕見未知突變的基因檢測；導(dǎo)流雜交技術(shù)的優(yōu)勢在于高靈敏度、操作簡易、成本低、耗時少，更適合大規(guī)模的臨床篩查。2種方法學(xué)結(jié)合檢測臨床非綜合征型聾病，檢測結(jié)果更為可靠、準(zhǔn)確、科學(xué)[關(guān)鍵詞]致聾基因GJB2；Sanger測序；導(dǎo)流雜交技術(shù)

AcomparativestudyonthedetectionofdeafnesssusceptibilitygeneGJB2bydifferentmethods—MethodologicalcomparisonbetweenSangersequencinganddiversionHybridization[Abstract]Objective:TocomparetheadvantagesanddisadvantagesofSangersequencinganddiversionhybridizationinthedetectionofcommondeafnesssusceptibilitygenes(GJB2)inpatientswithcongenitalsensorineuralhearinglossandtoexploreitsclinicalvalue.Methods:Sangersequencinganddiversionhybridizationwereusedtodetectthemutationofnon-syndromicinheriteddeafnesssusceptibilitygene(GJB2)in120casesofdeafness.Theresultsoftwomethodswerecompared.Results:ThemutationrateofSangersequencingwashigherthanthatofdiversionhybridization(χ2=4.167,P=0.031).Itssensitivitywaslowerthanthatofdiversionhybridization(χ2=15.54,P=0.001).TheaccuracyofSangersequencing(100%)washigherthanthatofdiversionhybridization(90%).Theconsumptiontimeismuchlongerthanthatofdiversionhybridization,andithasmoreflux.Conclusion:InthedetectionofdeafnessgeneGJB2mutationinChina,Sangersequencinghastheadvantagesofhighspecificity,highaccuracyandhighthroughput,soitismoresuitableforrareunknownmutationgenedetection.Theadvantagesofdiversionhybridizationarehighsensitivity,simpleoperation,lowcost,lesstimeconsumingandmoresuitableforlarge-scaleclinicalscreening.Thetwomethodscombinedwiththedetectionofclinicalnon-syndromicdeafnessaremorereliable,accurateandscientific.[Keywords]deafnessgeneGJB2;Sangersequencing;diversionhybridizationtechnique

目錄引言 11研究資料 21.1研究對象 21.2樣本類型 21.3DNA提取和保存 21.4主要的儀器、試劑及軟件 32研究方法 52.1PCR擴(kuò)增 62.2Sanger測序檢測 82.3導(dǎo)流雜交技術(shù) 132.4結(jié)果判讀 152.5統(tǒng)計學(xué)分析 163結(jié)果分析 173.1應(yīng)用Sanger測序檢測GJB2的結(jié)果 173.2應(yīng)用導(dǎo)流雜交技術(shù)檢測GJB2的結(jié)果 173.3兩種方法學(xué)的結(jié)果對比 183.4兩種方法學(xué)耗時、耗材以及通量的比較 244討論 25結(jié)論 27參考文獻(xiàn) 28致謝 31引言耳聾是由感音神經(jīng)功能紊亂所導(dǎo)致的疾病[1]，約60%新生聾兒是遺傳因素所致[2,3]。據(jù)遺傳特征推測，耳聾具有4種分型，分別為：1%性連鎖（DFNX-linked,DFNY-linked），約4%線粒體遺傳，15%常染色體顯性遺傳（DFNA），以及高達(dá)80%的常染色體隱性遺傳（DFNB）[4]。其中，占75%～80%常染色體隱性遺傳的非綜合征耳聾（NSHL）患者中，約有50%是由易感基因GJB2突變所致[5,6]。GJB2被視為最常見的耳聾致病基因[7]，其全稱為縫隙連接蛋白2（Gapjunctionprotein2），是第一個被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致常染色體隱性遺傳性耳聾的基因[8,9]。據(jù)分子流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，GJB2突變位點(diǎn)存在明顯的種族差異性：西方國家（歐洲、北美和中東等地）以35delG最為常見，猶太則為167delT，日本為235delC，而中國以235delC純合突變最常見，其突變檢出率高達(dá)13.64%～21.5%[10,11,12]，即每100人中至少有13～21人具有可致遺傳性耳聾的基因缺陷。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，235delC純合突變患者多數(shù)會出現(xiàn)重度或極重度聽力損失，且多為雙耳感音神經(jīng)性聾[13]。目前，耳聾已嚴(yán)重影響了人們的身心健康和家庭生活，大大增加了國家醫(yī)療支出，降低了我國人口素質(zhì)。在此背景下，實(shí)現(xiàn)耳聾的預(yù)防與干預(yù)應(yīng)刻不容緩：一級防控（婚前、孕前檢測）可降低后代耳聾發(fā)病率；二級防控（產(chǎn)前診斷）可減少耳聾出生缺陷；三級防控（新生兒篩查診斷）可實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)、早治療[14]。自上世紀(jì)70年代，Sanger與Coulson首次發(fā)表了有關(guān)雙脫氧鏈終止法測序技術(shù)的相關(guān)學(xué)術(shù)論文，即Sanger測序的論文，人類對基因檢測技術(shù)的研究便日趨深入，逐漸推動測序技術(shù)的飛速發(fā)展，同時也促進(jìn)了新的耳聾易感基因檢測技術(shù)的形成與建立[15]。目前，應(yīng)用于耳聾易感基因檢測的生物遺傳分子學(xué)檢測技術(shù)主要有：基于分子雜交的基因芯片、點(diǎn)雜交；基于核酸序列檢測的Sanger測序、二代測序；以及定量PCR技術(shù)、變性高效液相色譜分析、高分辨率熔解曲線分析等[16,17,18,19]。20世紀(jì)末至21世紀(jì)初，隨著Sanger測序廣泛應(yīng)用于耳聾易感致病基因的檢測，解放軍總醫(yī)院耳鼻喉科分子診斷中心相繼制定和建立了耳聾易感基因檢測以及產(chǎn)前診斷的策略與平臺，指導(dǎo)耳聾易感基因的診斷與治療，為降低耳聾出生率、提高全民聽力水平做出了巨大的貢獻(xiàn)[20,21]。鑒于Sanger測序的技術(shù)成熟和其在核酸測序的應(yīng)用廣泛，以及凱普生物公司自主創(chuàng)新的綜合PCR和低密度基因芯片的導(dǎo)流雜交技術(shù)在檢測HPV分型的高靈敏度臨床篩查意義[22,23]。本研究課題，將利用隨機(jī)抽取的凱普生物公司耳聾易感基因收檢樣本120例，分別應(yīng)用PCR基因芯片的導(dǎo)流雜交技術(shù)與DNA測序“金標(biāo)準(zhǔn)”的Sanger測序技術(shù)進(jìn)行對比研究，通過對比Sanger測序的核酸序列檢測結(jié)果與導(dǎo)流雜交技術(shù)的探針結(jié)合結(jié)果，比較兩種方法學(xué)在檢出率、準(zhǔn)確性、靈敏度的差異[24,25]，驗(yàn)證哪一種方法學(xué)更符合中國國情的耳聾臨床檢測，明確哪一種耳聾基因檢測診斷技術(shù)更為全面﹑準(zhǔn)確﹑高效，從而為臨床診斷提供安全﹑有效﹑科學(xué)的參考依據(jù)。1研究資料1.1研究對象通過收集凱普生物公司2018年收檢的所有檢測耳聾易感基因樣本資料，隨機(jī)抽取100個未知樣本（包括EDTA-全血樣本和DNA樣本）和20個陽性結(jié)果的DNA樣本。其中，未成年樣本22例（包括新生兒和嬰幼兒），占18.33%，成年人樣本98例，占81.67%。1.1.1納入標(biāo)準(zhǔn)GJB2基因突變所致的感音神經(jīng)性耳聾；疑似先天感音性耳聾。1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn)前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大或存在其他內(nèi)耳畸形；綜合征型耳聾；智力障礙、顱腦外傷導(dǎo)致的耳聾；C1494T或A1555G突變（母系遺傳的相關(guān)突變類型）。1.2樣本類型EDTA-全血樣本（靜脈外周血，成年人）：需要進(jìn)一步DNA提取操作才可使用；血斑卡樣本（足跟血，嬰幼兒）：也需要進(jìn)一步提取才可檢測；現(xiàn)成DNA樣本：由醫(yī)院以及其他機(jī)構(gòu)提取。1.3DNA提取和保存1.3.1DNA的提取EDTA-全血樣本的處理：取已加入抗凝劑EDTA(乙二胺四乙酸）的血液樣本200ul，采用潮州凱普公司的離心柱型血液基因組DNA提取試劑盒，進(jìn)行手動提取血液白細(xì)胞中的DNA基因組[26]；加入20ul蛋白酶K，降解血液中的蛋白，再加200ul裂解液（溶液L），震蕩離心，于56℃下溫浴18min，期間顛倒混勻4次；加入200ul無水乙醇沉淀DNA，再加500ul雜質(zhì)洗脫液（溶液W1和溶液W2）洗脫核蛋白、糖類和RNA等雜質(zhì)3次（溶液W1洗脫1次，溶液W2洗脫2次）；加入提前預(yù)熱至56℃TE洗脫液60ul，將DNA從離心柱上洗脫下來，置于新的1.5mlEP管。取2ulDNA，采用百泰克公司的超微量紫外可見分光光度計檢測DNA的溶度（ng/ul）和純度（A260/A280，其范圍在1.6-2.0）。血斑卡DNA提取的后半部分與EDTA-全血樣本提取一致，前三步操作為：用酒精燈消毒（避免交叉污染）后的剪刀沿著邊緣剪下一孔血斑卡，剪碎，置于1.5ml的EP管，加入溶液T（細(xì)胞裂解液）300ul(加入量可稍作調(diào)整，以保證沒過血斑卡碎紙），再加蛋白酶K20ul，充分震蕩混勻；將EP管于56℃下溫浴20min，期間顛倒混勻4-5次；再加溶液L200ul，震蕩混勻，于70℃下溫浴15min；加入預(yù)冷的無水乙醇200ul，后續(xù)操作與EDTA-全血樣本的提取操作一致。1.3.2DNA的保存DNA樣本需保存在-20℃環(huán)境中，且不得超過3個月，反復(fù)凍融次數(shù)不得超過6次，否則DNA會發(fā)生降解。1.4主要的儀器、試劑及軟件1.4.1主要的儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)中主要的儀器設(shè)備，見表1.1。表1.1實(shí)驗(yàn)的儀器設(shè)備儀器名稱型號出廠商3500xl基因分析儀3500XL,DX美國ABI公司醫(yī)用核酸分子雜交儀HB-2012A廣東凱普生物科技股份有限公司PCR擴(kuò)增儀ProFlexTM3X32-Well美國ABI公司全自動凝膠成像分析系統(tǒng)GELDOCXRFBIO-RAD集團(tuán)雙穩(wěn)定時電泳儀電源DYY-6C北京市六一儀器廠瓊脂糖水平電泳儀DYCP-31DN北京六一儀器廠超微量紫外可見分光光度計ND5000百泰克生物技術(shù)有限公司核酸檢測儀ND-2000C(C)廣東省農(nóng)墾集團(tuán)進(jìn)出口有限公司臺式高速冷凍離心機(jī)5810R德國EPPendorf（艾本德）公司干式恒溫器MK-2000-2E奧盛集團(tuán)漩渦混合器V3S025德國IKA公司微型離心機(jī)MINI-6K珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司微孔板離心機(jī)MINI2596珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司離心機(jī)5418德國EPPendorf公司電子天平ME2002梅特勒-托利多生物安全柜BSC-110ⅡA2-X濟(jì)南鑫貝兩生物技術(shù)有限公司微量移液槍吉爾森/百得微波爐P70020P-N9(WO)格蘭仕（注：微量移液槍的規(guī)格有：2ul、2.5ul、10ul、20ul、100ul、200ul以及1000ul。）1.4.2主要的試劑潮州凱普生物公司的血液基因組DNA提取試劑盒、廣州凱普公司的耳聾易感基因檢測試劑盒—PCR試劑（PCR+導(dǎo)流雜交法）、廣州凱普公司的耳聾易感基因檢測試劑盒—雜交試劑（PCR+導(dǎo)流雜交法）、生工公司的耳聾易感基因檢測引物、ABI公司的普通PCR試劑盒、ABI公司的BigDyeTerminator測序PCR試劑盒；瓊脂糖粉、寶日醫(yī)公司的LD1000DNAMarker、TAKARA公司的10×LoadingBuffer、賽百威的GoldView染料、1×TAE緩沖液；ABI公司的磁珠、無水乙醇、125mMEDTA(PH=8.0)、3MNaAc(PH=5.2)、Hi-Di甲酰胺。1.4.3主要的軟件Chromas軟件：分析測序結(jié)果3500Series2軟件：3500xl基因測序儀配套軟件SeqA6軟件：實(shí)現(xiàn)測序結(jié)果中峰圖與序列的相互轉(zhuǎn)化APE_win_current軟件：用于基因編輯，實(shí)現(xiàn)兩序列比對BioEdit軟件：分析核苷酸序列，蛋白質(zhì)序列等ImageLad軟件：全自動凝膠成像分析系統(tǒng)配套軟件CNKIE-Study軟件：閱讀CAJ、Pdf格式文獻(xiàn)資料SPSSStatistics軟件：分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的相關(guān)性Excel：記錄、匯總實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)2研究方法對隨機(jī)抽取100個未知樣本和20個陽性結(jié)果的DNA樣本分別進(jìn)行Sanger測序和導(dǎo)流雜交，對比兩種方法學(xué)的陽性檢出率，并從陽性樣本中分別抽取2例235delC突變樣本、1例299delAT突變樣本、1例176del16突變樣本，均稀釋成為1ng/ul﹑2ng/ul﹑3ng/ul﹑5ng/ul﹑10ng/ul﹑15ng/ul和20ng/ul等濃度。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，分別用這兩種方法進(jìn)行檢測，分別從準(zhǔn)確率、靈敏度進(jìn)行兩種方法學(xué)的對比。并用Excel表格記錄所有的檢測結(jié)果，聯(lián)合SPSSStatistics17.0軟件，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分類、歸納、分析和統(tǒng)計。具體的研究實(shí)驗(yàn)如下：2.1PCR擴(kuò)增原理：與DNA的天然復(fù)制過程相似，遵循堿基互補(bǔ)配對原則，并以與目的序列互補(bǔ)的單鏈核苷酸為引物，進(jìn)行特異性擴(kuò)增。目的：擴(kuò)增DNA目的片段。2.1.1測序普通PCR取2.5ulDNA，加入ABI公司的PCR擴(kuò)增試劑，用PCR擴(kuò)增儀對目的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系、檢測位點(diǎn)：分別見表2.1、表2.2；擴(kuò)增反應(yīng)過程：見圖2.1。表2.1GJB2基因PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系（25.00ul）試劑加樣量（ul）備注模板DNA2.5目的DNA基因組片段10×PCRBuffer2.5提供穩(wěn)定的反應(yīng)環(huán)境25mMMgCl23.6潤滑劑，Taq酶激活劑25mMdNTPs0.3核苷酸原料：dATPs﹑dTTPs﹑dGTPs﹑dCTPsGJB2-FPrimers1.5正向引物GJB2-RPrimers1.5反向引物RocheTaq酶0.75DNA聚合酶，催化DNA合成ddH2O12.35去離子水合計25.00表2.2ABI公司的測序普通PCR試劑盒檢測GJB2的位點(diǎn)主要包括：檢測位點(diǎn)突變類型突變點(diǎn)簡稱GJB2-235delC235MGJB2-299delAT299MGJB2-176delGCTGCAAGAACGTGTG176MGJB2-155delTCTGGJB2-35delG35M圖2.1GJB2基因PCR擴(kuò)增的反應(yīng)過程2.1.2雜交PCR取兩份相同DNA各2ul，加入凱普公司的PCR擴(kuò)增試劑盒，用PCR擴(kuò)增儀對目的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系、檢測位點(diǎn)：見表2.3、表2.4；擴(kuò)增反應(yīng)過程：見圖2.2。表2.3GJB2基因?qū)Я麟s交PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（30.0ul)試劑加入量（ul）備注A管A組PCR混合液27.5合計：30.04對引物（0.2ul），1×Buffer，3.0mMMgCl2，0.4mMdNTPsDNA聚合酶0.5催化DNA擴(kuò)增合成模板DNA2.0目的擴(kuò)增基因組片段B管B組PCR混合液27.5合計：30.04對引物（0.1ul），1×Buffer，3.0mMMgCl2，0.4mMdNTPsDNA聚合酶0.5催化DNA擴(kuò)增合成模板DNA2.0目的擴(kuò)增基因組片段表2.4凱普公司的雜交PCR試劑盒檢測GJB2的位點(diǎn)包括：檢測位點(diǎn)突變類型突變點(diǎn)簡稱GJB2-235delC235MGJB2-299delAT299MGJB2-176delGCTGCAAGAACGTGTG176MGJB2-35delG35MGJB2-155delTCTG圖2.2GJB2基因?qū)Я麟s交PCR擴(kuò)增反應(yīng)過程2.2Sanger測序檢測2.2.12%瓊脂凝膠回收：原理：帶負(fù)電的磷酸根殘基均存在于DNA的雙螺旋骨架兩側(cè)，在通電情況下，能使不同長度的DNA片段在包含電解質(zhì)的多孔介質(zhì)凝膠上進(jìn)行不同的遷移，從而形成不同距離的DNA條帶。目的：分離DNA片段，鑒定PCR擴(kuò)增效果。實(shí)驗(yàn)：根據(jù)樣本量的多少配置相應(yīng)大小的凝膠，具體反應(yīng)體系：見表2.5。表2.5不同樣本量所對應(yīng)的不同加樣量的瓊脂糖凝膠反應(yīng)體系瓊脂糖粉加入量（g）1×TAE緩沖液加入量（ml）GoldView染料加入量（ul）微波爐加熱時間（min）1-11人份0.40020.01.0112-24人份0.80040.02.0225-100人份1.60080.04.02具體實(shí)驗(yàn)操作：根據(jù)樣本量，稱取適量的瓊脂糖粉于500ml的錐形瓶，量取適量的1×TAE緩沖液加入瓶中，套上錫箔紙瓶蓋，微波爐加熱適當(dāng)時間；加入適量的GoldView染料，轉(zhuǎn)移至膠板上，自然冷卻1h（或者放4℃冰箱30min），拔去梳子，并檢查膠孔的完整性；將配置完成的2%瓊脂凝膠置于瓊脂糖水平電泳儀，在第一個膠孔加入4ul的LD1000DNAMarker（分子量參照物）；取PCR擴(kuò)增完成的樣本4ul，加入1ul的10×LoadingBuffer（示蹤染料），混合均勻后，取4ul加入到第二個膠孔，依次操作，將所有的樣本加入膠孔，并記錄點(diǎn)樣的編號和位置；插上電極，打開雙穩(wěn)定時電泳儀電源，在150V，電泳20min；電泳跑膠完畢，關(guān)閉電源，取出凝膠，使用全自動凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行成像拍照，編輯條帶信息（一般地，跑出來的條帶數(shù)量與加入的引物對數(shù)成正相關(guān)，測序普通PCR一般只有一對引物，故只有一個條帶，示例：見圖2.3）。圖2.3GJB2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳成像2.2.2磁珠回收原理：一定濃度的聚乙二醇（PEG）和鹽離子，可使DNA吸附到含有羧基的高分子磁珠表面。此過程是可逆的，即DNA可被洗脫下來。目的：去除非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體。具體實(shí)驗(yàn)操作：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物震蕩均勻，離心，加入50ul磁珠，震蕩混勻，轉(zhuǎn)移至新的1.5mlEP管；靜置5min后，轉(zhuǎn)移至磁力架上，靜置3min，去除上清液（吸液時注意槍頭要置于遠(yuǎn)離磁珠一側(cè)，切勿吸到磁珠，否則要打出清液，在磁力架上重新靜置）；再加入70%酒精（現(xiàn)配現(xiàn)用）200ul，振蕩混勻后，瞬離，靜置5min，放置于磁力架上靜置3min，去除上清液；再次酒精洗滌（注意：此時應(yīng)徹底去除上清液，確保無成流或成滴的酒精殘留）；開蓋晾干約15min（注意：不低于10min，確保無酒精殘留，排除后期測序跑膠酒精峰對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響）；加入57ul去離子純化水，振蕩混勻，瞬離，靜置5min，放置于磁力架上靜置5min，吸取50ul上清液于新的1.5mlEP管中。2.2.3測序PCR原理：在DNA聚合酶的催化和雙脫氧核苷酸（ddNTP)的終止擴(kuò)增作用下，發(fā)生大量的隨機(jī)終止擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生一系列長度只相差一個堿基的DNA片段。目的：根據(jù)不同長度的DNA片段的電泳速度不同，上測序儀電泳，就能檢測出整段DNA的序列。具體實(shí)驗(yàn)操作：測序PCR前，必須先用核酸檢測儀測定磁珠回收產(chǎn)物的濃度，確保滿足測序PCR的DNA加入量（根據(jù)PCR產(chǎn)物的長度在200-500bP，為保證后期上機(jī)測序結(jié)果清晰準(zhǔn)確，要求加入DNA模板量在10ng左右，故DNA的濃度最好在10ng/ul，若是大于該濃度，應(yīng)先用去離子純化水進(jìn)行稀釋）各取1.0ulDNA（當(dāng)DNA的濃度不滿足測序PCR的要求時，其加入量可根據(jù)實(shí)際濃度做適當(dāng)調(diào)整），加入ABI公司的測序PCR試劑盒，用PCR擴(kuò)增儀對目的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系1/8X：分別見表2.6；擴(kuò)增反應(yīng)程序：見圖2.4。表2.6GJB2基因測序PCR的反應(yīng)體系1/8X（10.00ul）試劑名稱加入量（ul）備注上游（正向）端測序反應(yīng)F5×SeqBuffer緩沖液1.75合計：10.00當(dāng)TemplateDNA≥9.0ng/ul時，TemplateDNA與ddH20的加入量是一定的；當(dāng)TemplateDNA<9.0ng/ul時，TemplateDNA的加入量可適當(dāng)增加（確保加入量在10ng左右），而ddH20的加入量應(yīng)相應(yīng)地減少，維持整個體系在10ul。BigDye染料0.5GJB2F-Primer3.2μM1.0TemplateDNA1.0ddH205.75下游（反向）端測序反應(yīng)R5×SeqBuffer緩沖液1.75合計：10.00BigDye染料0.5GJB2R-Primer3.2μM1.0TemplateDNA1.0ddH205.75圖2.4GJB2基因測序PCR的反應(yīng)程序2.2.4酒精/EDTA/NaAc法純化產(chǎn)物原理：DNA的多聚陰離子能與很多1價、2價的離子結(jié)合成鹽，在有機(jī)溶劑中即不溶解也不變性，且在-4℃下能形成沉淀。目的：主要去除殘留的BigDig染料和多余的熒光標(biāo)記ddNTPs。采用ABI公司的純化試劑進(jìn)行酒精純化。其反應(yīng)體系：見表2.7。表2.7GJB2測序PCR產(chǎn)物的酒精純化反應(yīng)體系試劑名稱加入量（ul）備注125mMEDTA(PH=8.0)1:1混勻，2緩沖液3MNaAc(PH=5.2)加速DNA沉淀無水乙醇30洗脫雜質(zhì)70%乙醇35需現(xiàn)配現(xiàn)用，洗脫兩次高濃度Hi-Di甲酰胺10可保存DNA單鏈狀態(tài)1周，但最好在24h內(nèi)上機(jī)測序具體實(shí)驗(yàn)操作：開啟臺式高速冷凍離心機(jī)電源，設(shè)置溫度為4℃進(jìn)行機(jī)內(nèi)環(huán)境預(yù)冷；將測序PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到96孔板，并記錄好樣本的編號和位置；取125mMEDTA(PH=8.0)和3MNaAc(PH=5.2)1：1混合后2ul，加入每個樣本孔孔底；往樣本孔內(nèi)加入無水酒精30ul，用封孔膜封嚴(yán)，充分振蕩混勻后，冰箱-20℃放置5min；將96孔板轉(zhuǎn)移至臺式高速冷凍離心機(jī)，在轉(zhuǎn)速為3000r、溫度為4℃下冷凍離心15min后，取出96孔板倒置，瞬離（轉(zhuǎn)速1300r左右），甩干管中的液體；往每個樣本孔內(nèi)加入70%酒精（現(xiàn)配現(xiàn)用）35ul，在3000r、4℃下，冷凍離心5min，同樣地，馬上倒置96孔板，瞬離，甩干管中的液體；再用70%酒精重復(fù)洗滌1次，在相同條件下，冷凍離心5min，瞬離，甩干管中的液體（轉(zhuǎn)速可達(dá)1500r）；開蓋讓殘余的酒精自然揮干，約15min。往每個樣本孔加入Hi-Di甲酰胺10ul，吹打混勻，使DNA與Hi-Di甲酰胺試劑充分混勻，以維持DNA單鏈狀態(tài)。2.2.5上機(jī)測序原理：測序PCR中摻入一定比例的ddNTPs(不同ddNTP帶著不同發(fā)光基團(tuán)），產(chǎn)生的一系列相差一個堿基的單鏈DNA片段，通過電泳收集熒光信號，確定末端的ddNTP，綜合所有末端熒光信號，即可檢測到整段DNA的堿基序列。具體實(shí)驗(yàn)：將加入Hi-Di甲酰胺試劑的96孔板放入3500xl基因分析儀的內(nèi)槽，在FastSequency程序下進(jìn)行核酸雙向測序，一般地，一個注射可以實(shí)現(xiàn)12個樣本的雙向檢測，用時為1h15min，最多可同時測序4個注射，即48個樣本（雙向）。測序的整個過程和結(jié)果可在3500Series2軟件上查看，峰圖結(jié)果可在SeqA6軟件上轉(zhuǎn)化為核酸序列，結(jié)果分析可在Chromas軟件或者BioEdit軟件進(jìn)行，基因編輯、對比分析可在APE_win_current軟件上實(shí)現(xiàn)。2.3導(dǎo)流雜交技術(shù)原理：利用含有生物素標(biāo)記的引物擴(kuò)增目的DNA片段，將產(chǎn)物變性成單鏈后，與尼龍膜條上的特異基因探針進(jìn)行導(dǎo)流雜交，并通過化學(xué)顯色來判讀結(jié)果。2.3.1實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備將雜交液、洗脫液（WB1）預(yù)熱至45℃；將其他試劑平衡至25℃。2.3.2雜交實(shí)驗(yàn)具體實(shí)驗(yàn)操作見圖2.5開啟雜交儀電源，設(shè)置溫度為45℃進(jìn)行升溫開啟雜交儀電源，設(shè)置溫度為45℃進(jìn)行升溫用蒸餾水清洗反應(yīng)室，開泵，依次放置金屬多孔板、塑料薄膜、雜交探針膜條（濕潤且無氣泡）、硅膠封圈和分隔室；固定壓扣蓋，升起反應(yīng)室，泵走殘留液體后，關(guān)泵用蒸餾水清洗反應(yīng)室，開泵，依次放置金屬多孔板、塑料薄膜、雜交探針膜條（濕潤且無氣泡）、硅膠封圈和分隔室；固定壓扣蓋，升起反應(yīng)室，泵走殘留液體后，關(guān)泵PCR產(chǎn)物(A、B組)于95℃變性7min，、冰水浴2min（使DNA處于單鏈狀態(tài)）PCR產(chǎn)物(A、B組)于95℃變性7min，、冰水浴2min（使DNA處于單鏈狀態(tài)）往雜交孔內(nèi)加雜交液800ul，溫育2min后，開泵排液，關(guān)泵往雜交孔內(nèi)加雜交液800ul，溫育2min后，開泵排液，關(guān)泵在45℃下，加雜交液800ul，把變性后的PCR產(chǎn)物(A、B組)混勻，加入相應(yīng)反應(yīng)槽，溫育20min后，開泵排液，關(guān)泵在45℃下，加雜交液800ul，把變性后的PCR產(chǎn)物(A、B組)混勻，加入相應(yīng)反應(yīng)槽，溫育20min后，開泵排液，關(guān)泵用洗脫液(WB1)沖洗膜4次，每次800ul，間隔5sec，排液完畢后關(guān)泵用洗脫液(WB1)沖洗膜4次，每次800ul，間隔5sec，排液完畢后關(guān)泵設(shè)定溫度為25℃進(jìn)行降溫設(shè)定溫度為25℃進(jìn)行降溫加500ul封阻液，立即開泵排液，關(guān)泵，再加500ul封阻液，封膜5min后，開泵排液，關(guān)泵加500ul封阻液，立即開泵排液，關(guān)泵，再加500ul封阻液，封膜5min后，開泵排液，關(guān)泵在25℃下，加500ul酶標(biāo)液，酶標(biāo)5min后，開泵排液，關(guān)泵在25℃下，加500ul酶標(biāo)液，酶標(biāo)5min后，開泵排液，關(guān)泵設(shè)定溫度為36℃進(jìn)行升溫；用溶液A徹底洗膜4次，每次800ul，間隔5sec設(shè)定溫度為36℃進(jìn)行升溫；用溶液A徹底洗膜4次，每次800ul，間隔5sec在36℃下，加500ul顯色液(NBT/BC|P)，避光顯色3min后，開泵排液，關(guān)泵在36℃下，加500ul顯色液(NBT/BC|P)，避光顯色3min后，開泵排液，關(guān)泵用雜交液洗膜3次，每次800ul，開泵，再用蒸餾水漂洗后，關(guān)泵用雜交液洗膜3次，每次800ul，開泵，再用蒸餾水漂洗后，關(guān)泵降下反應(yīng)室，打開壓扣蓋，取出分隔室和硅膠封圈，取出雜交膜，并用吸水紙上吸干，在1h內(nèi)觀察結(jié)果降下反應(yīng)室，打開壓扣蓋，取出分隔室和硅膠封圈，取出雜交膜，并用吸水紙上吸干，在1h內(nèi)觀察結(jié)果圖2.5導(dǎo)流雜交實(shí)驗(yàn)過程2.4結(jié)果判讀2.4.1Sanger測序結(jié)果判讀在高質(zhì)量清晰的測序峰圖條件下，進(jìn)行結(jié)果判讀和分析：一般地，野生型為高質(zhì)量單峰（但純合突變也為單峰，故判讀基因是否突變還需結(jié)合正常序列進(jìn)行比對確認(rèn)），而套峰或者雙峰，出現(xiàn)堿基序列的缺失或錯義，則為突變型[32]。示例：見圖2.6﹑圖2.7。圖2.6GJB2野生型圖2.7GJB2突變型2.4.2導(dǎo)流雜交結(jié)果判讀膜條上基因探針的排列順序：見表2.8表2.8膜條上基因探針排位Biotin35N155N176N235N299N35M155M176M235M299M1494N1555N7445N538NIVS-N2168N1494M1555M7445M538MIVS-M2168M1229N1229M12201N12201M結(jié)果判讀：觀察膜條上出現(xiàn)的藍(lán)紫色斑點(diǎn)：（注：帶字母“N”的代表正常位點(diǎn)，帶字母“M”的代表突變位點(diǎn)）空白對照：僅在生物素點(diǎn)（Biotin處）出現(xiàn)斑點(diǎn)；野生型樣本：在生物素點(diǎn)及所有正常探針處出現(xiàn)斑點(diǎn)；陽性樣本：若正常探針及對應(yīng)的突變探針位點(diǎn)都出現(xiàn)斑點(diǎn)，則該位點(diǎn)為雜合突變；若突變探針處岀現(xiàn)斑點(diǎn)，而對應(yīng)的正常探針位點(diǎn)沒有岀現(xiàn)斑點(diǎn)，則該位點(diǎn)為純合突變。示例：見圖2.8、圖2.9、圖2.10、圖2.11。圖2.8空白對照圖2.9野生型樣本圖2.10176M突變雜合子圖2.11235M突變純合子2.5統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩種方法學(xué)的對比通常為組間比較資料，可用χ2檢驗(yàn)。對于樣本量比較多（大于等于40）者，檢出率比較可用配對四格表資料的χ2檢驗(yàn)；靈敏度比較可用R×C列聯(lián)表資料的χ2檢驗(yàn)。若P值<0.05，則兩者為有顯著差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義。對于樣本量比較少（小于40），且進(jìn)行了重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性對比研究實(shí)驗(yàn)的計數(shù)對比資料，則可用例數(shù)百分比來描述[27,28]。3結(jié)果分析3.1應(yīng)用Sanger測序檢測GJB2的結(jié)果隨機(jī)抽取的100例耳聾送檢樣本中，除去檢測失敗2例，共檢出98例。致病突變檢出19例，等位基因檢出45例，其中235delC的等位基因頻率為最高，占21.43%（42/196）,其余60例均未檢測到GJB2的任何突變。詳情見表3.1。表3.1Sanger測序的檢測結(jié)果突變類型例數(shù)所占比例復(fù)合雜合突變（7.14%）c.176-191del16及c.235delC雙雜合突變22.04%c.235delC及c.299delAT雜合突變55.10%純合突變（12.24%）c.235delC純合突變1111.22%c.299delAT純合突變11.02%單雜合突變（19.39%）c.235delC雜合突變1313.27%c.299delAT雜合突變11.02%c.176-191del16雜合突變11.02%c.109G>A(P.Val37lle)雜合突變22.04%3.2應(yīng)用導(dǎo)流雜交技術(shù)檢測GJB2的結(jié)果隨機(jī)抽取的100例耳聾送檢樣本中，除去檢測失敗5例，共檢出95例。致病突變檢測出19例，等位基因檢測出39例，其中235M的等位基因頻率為最高，占20.00%（38/190），其余63例均未檢測到GJB2的任何突變。詳情見表3.2。表3.2導(dǎo)流雜交技術(shù)的檢測結(jié)果突變類型例數(shù)所占比例復(fù)合雜合突變（7.37%）176M雜合突變及235M雜合突變22.11%235M雜合突變及299M雜合突變55.23%純合突變（12.63%）235M純合子1111.58%299M純合子11.05%單雜合突變（13.68%）235M雜合子99.47%299M雜合子11.05%176M雜合子11.05%3.3兩種方法學(xué)的結(jié)果對比3.3.1GJB2基因突變檢出率的對比Sanger測序與導(dǎo)流雜交檢測GJB2突變率的比較Sanger測序成功檢測樣本98例，其中38例為易感基因GJB2突變，突變檢出率為38.78%；導(dǎo)流雜交技術(shù)成功檢測95例，其中32例檢出為易感基因GJB2突變，突變檢出率為33.68%。Sanger測序檢出為陽性的38例樣本中，235delC突變31例（31.63%），其中24例（24.49%）為單純235delC突變，檢出率最高；299delAT突變9例，其中4例為單純299delAT突變；176-191del16突變3例，其中1例為單純176-191del16突變；以及109G>A(P.Val37lle)突變2例（2.04%），檢出率最低，見表3.3、圖3.1。導(dǎo)流雜交技術(shù)檢出為陽性的32例樣本中，235delC突變27例（28.42%），其中20例（21.05%）為單純235delC突變，檢出率最高；299delAT突變9例，其中4例為單純299delAT突變；176-191del16突變3例（3.16%），其中1例（1.05%）為單純176-191del16突變，檢出率最低，見表3.3、圖3.2。Sanger測序檢出率大于導(dǎo)流雜交技術(shù)，P值為0.031，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）,見表3.4。表3.32種方法學(xué)檢測GJB2基因突變檢出數(shù)（檢出率）的比較突變類型Sanger測序?qū)Я麟s交技術(shù)復(fù)合雜合單純突變復(fù)合雜合單純突變235delC突變7（7.14%）24（24.49%）7（7.37%）20（21.05%）299delAT突變5（5.10%）4（4.08%）5（5.26%）4（4.21%）176-191del16突變2（2.04%）1（1.02%）2（2.11%）1（1.05%）109G>A(P.Val37lle)02（2.04%）00圖3.1Sanger測序法檢測GJB2基因突變的結(jié)果圖3.1Sanger測序法檢測GJB2基因突變的結(jié)果圖3.2導(dǎo)流雜交技術(shù)檢測GJB2基因突變的結(jié)果表3.42種方法學(xué)檢測GJB2基因突變結(jié)果的比較Sanger測序?qū)Я麟s交技術(shù)合計χ2值P值突變型野生型突變型326384.1670.031野生型06060合計326698（注：χ2值的計算：當(dāng)b+c>=40，v=1時，χ2=(b-c)2/(b+c)；當(dāng)b+c<40，v=1時,χ2=(|b-c|-1)2/(b+c)。）致病檢出率﹑等位基因檢出率的比較由Sanger測序和導(dǎo)流雜交技術(shù)的檢測結(jié)果可看出：Sanger測序檢測GJB2的等位基因檢出率高于導(dǎo)流雜交技術(shù)；導(dǎo)流雜交技術(shù)檢測GJB2的致病檢出率高于Sanger測序。詳情見表3.5，表3.6。表3.5兩種方法學(xué)對GJB2致病基因的檢出數(shù)對比致病基因型Sanger測序?qū)Я麟s交技術(shù)235delC/235delC1111235delC/299delAT55235delC/176-191del1622299delAT/299delAT11總計19（19.39%=19/98）19（20.00%=19/95）表3.6兩種方法學(xué)對GJB2等位基因的檢出數(shù)對比突變位點(diǎn)Sanger測序?qū)Я麟s交技術(shù)235delC4238299delAT1010176-191del1633109G>A(P.Val37lle)20總計57（29.08%=57/196）51（26.84%=51/190）3.3.2檢測GJB2基因突變的準(zhǔn)確性對比隨機(jī)抽取的20例陽性樣本，分別采用同一批檢測試劑盒，同一批檢測儀器，同一實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，同時進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，3組檢測結(jié)果均一致，重復(fù)性結(jié)果滿足兩個獨(dú)立檢測結(jié)果之差在95%的概率水平以內(nèi)。抽檢的樣本中，11例為235雜合突變，2例235純合突變，5例299雜合突變，2例176雜合突變。應(yīng)用Sanger測序檢測出結(jié)果與已知結(jié)果相同（準(zhǔn)確率為100.00%），其中，2例檢測底峰較高，但不影響結(jié)果判讀。應(yīng)用導(dǎo)流雜交技術(shù)檢測出的結(jié)果，其中，2例無法識別判讀；2例點(diǎn)淺，但可識別，準(zhǔn)確率為90.00%（18/20）,明顯較低，詳情見表3.7。表3.7兩種方法學(xué)檢測GJB2陽性樣本的結(jié)果比較編號濃度（ng/ul）樣本純度（A260/A280）對照結(jié)果雜交結(jié)果測序結(jié)果123.001.70299雜合突變299M雜合299delAT雜合突變233.001.82235雜合突變235M雜合235delC雜合突變338.001.80235雜合突變235M雜合235delC雜合突變434.001.79176雜合突變176M雜合176-191del16雜合突變516.001.60235雜合突變235M雜合，突變點(diǎn)淺235delC雜合突變619.001.72176雜合突變176M雜合176-191del16雜合突變749.001.78299雜合突變299M雜合299delAT雜合突變812.001.59235雜合突變多個正常位點(diǎn)點(diǎn)淺，識別不出異常位點(diǎn)235delC雜合突變，底峰較高952.001.74235雜合突變235M雜合235delC雜合突變1038.001.80235雜合突變235M雜合235delC雜合突變1144.001.76299雜合突變299M雜合299delAT雜合突變續(xù)表3.7編號濃度（ng/ul）樣本純度（A260/A280）對照結(jié)果雜交結(jié)果測序結(jié)果1242.001.75299雜合突變299M雜合299delAT雜合突變1333.001.83235雜合突變235M雜合235delC雜合突變1414.001.60235雜合突變235M雜合,突變點(diǎn)淺235delC雜合突變1524.001.84235雜合突變235M雜合235delC雜合突變1639.001.74235純合突變235M純合235delC純合突變1752.001.72299雜合突變299M雜合299delAT雜合突變1810.001.58235雜合突變多個正常位點(diǎn)點(diǎn)淺，識別不出異常位點(diǎn)235delC雜合突變，底峰較高1947.001.69235雜合突變235M雜合235delC雜合突變2045.001.75235純合突變235M純合235delC純合突變3.3.3檢測GJB2基因突變的靈敏度對比從陽性樣本中抽取DNA濃度和純度相對適合的235delC突變樣本2例、176del16突變樣本1例、299delAT突變樣本1例，分別稀釋為1ng/ul﹑2ng/ul﹑3ng/ul﹑5ng/ul﹑10ng/ul﹑15ng/ul和20ng/ul等濃度。濃度為15ng/ul和20ng/ul，兩種方法學(xué)均能清晰檢測出結(jié)果；濃度為10ng/ul，兩者基本能檢測出結(jié)果，其中，1例應(yīng)用Sanger測序檢測出底峰偏高，但能識別判讀；濃度為5ng/ul，Sanger測序均出現(xiàn)底峰偏高，導(dǎo)流雜交技術(shù)除了1例點(diǎn)淺，其余均能清晰識別；濃度為1ng/ul和2ng/ul，導(dǎo)流雜交技術(shù)均能進(jìn)行結(jié)果判讀，Sanger測序則全是亂峰﹑套峰，完全無法判讀，詳見表3.8。Sanger測序檢測GJB2基因突變的可識別率為57.14%（18/28），導(dǎo)流雜交技術(shù)為100%（28/28），總可識別率為78.57%（44/56）?？梢姡瑢?dǎo)流雜交技術(shù)的靈敏度遠(yuǎn)高于Sanger測序。通過R×C列聯(lián)表資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，χ2值為15.54，P值為0.001（遠(yuǎn)小于0.05），該統(tǒng)計學(xué)比較分析具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表3.9。表3.82種方法學(xué)檢測GJB2基因突變的靈敏度比較樣本編號濃度（ng/ul)純度（A260/A280)檢測判讀識別程度備注Sanger測序?qū)Я麟s交技術(shù)21.001.80－＋235delC雜合突變2.001.80－＋3.001.80－＋＋5.001.79＋＋＋10.001.80＋＋＋＋＋15.001.80＋＋＋＋＋＋20.001.80＋＋＋＋＋＋41.001.79－＋176-191del16雜合突變2.001.79－＋3.001.80－＋＋5.001.79＋＋＋10.001.79＋＋＋＋＋15.001.79＋＋＋＋＋＋20.001.79＋＋＋＋＋＋71.001.78－＋299delAT雜合突變2.001.78－＋3.001.79－＋＋5.001.78＋＋＋10.001.78＋＋＋＋15.001.79＋＋＋＋＋＋20.001.78＋＋＋＋＋＋201.001.75－＋235delC純合突變2.001.74－＋3.001.75－＋5.001.75＋＋＋10.001.75＋＋＋＋＋15.001.74＋＋＋＋＋＋20.001.75＋＋＋＋＋＋（注：檢測可判讀識別程度可用“+”/“-”表示。其中，“+++”表示檢測結(jié)果很清晰，易判讀；“++”則表示清晰可識別，能判讀；“+”表示可識別，勉強(qiáng)能判讀；而“—”表示不可識別，難以判讀。）表3.92種方法學(xué)檢測GJB2基因突變的可識別判讀程度組別例數(shù)易識別可識別勉強(qiáng)可識別不可識別χ2值P值Sanger測序288351215.540.001導(dǎo)流雜交技術(shù)2812790合計5620101412（注：χ2值的計算：χ2=56×[82/（28×20）+32/（28×10）+…+92/（28×14）+0－1]=15.54自由度的計算：v=（2-1）×（4-1）=3。）3.4兩種方法學(xué)耗時、耗材以及通量的比較以14個耳聾易感基因GJB2樣本量為例，DNA提取需1.5-2h，消耗凱普公司的離心柱型血液基因組DNA提取試劑盒一組，1.5mlEP管28個，2.0ml帶濾芯EP管14個。Sanger測序法檢測GJB2基因突變需檢測雙端（正向和反向），均要經(jīng)歷“普通PCR－凝膠電泳－磁珠回收－測序PCR－酒精純化－上機(jī)測序”多個步驟，總耗時為15h，通量為96，還需消耗112個EP管，1個96孔板，封孔膜若干，以及實(shí)驗(yàn)室里其他常見耗材（如，吸水紙、槍頭等）；導(dǎo)流雜交技術(shù)也要進(jìn)行雙管檢測，但只需經(jīng)過“PCR擴(kuò)增－凝膠電泳－變性雜交”三個環(huán)節(jié)，總耗時為6h，通量為14（除去空白對照），還需消耗PCR擴(kuò)增中用到的28個EP管，以及少量的實(shí)驗(yàn)室常見耗材。在試劑消耗方面，Sanger測序法除了PCR擴(kuò)增試劑盒﹑BigDyeTerminator測序PCR試劑盒、凝膠電泳試劑的消耗，還需要大量的純化試劑，包括無水乙醇﹑70%乙醇﹑磁珠﹑125mMEDTA﹑3MNaAc；以及大量去離子純化水﹑高純度Hi-Di甲酰胺試劑和3500XL測序儀上電極緩沖液；相比之下，導(dǎo)流雜交技術(shù)耗材少了許多，只需要消耗PCR擴(kuò)增試劑盒﹑雜交試劑盒以及凝膠電泳試劑?？傮w上，Sanger測序法檢測GJB2基因突變耗時比導(dǎo)流雜交技術(shù)長﹑耗材比導(dǎo)流雜交技術(shù)多﹑通量比導(dǎo)流雜交技術(shù)大。4討論全國性聾病分子流行病學(xué)的調(diào)查研究表明，中國人群的常見耳聾致病基因的攜帶率非常高，是導(dǎo)致中國耳聾高發(fā)的主要原因。GJB2、SLC26C4、mtDNA基因的突變攜帶率分別是3%、2%～3%、約0.33%，其中GJB2的攜帶率為最高[20]。本課題主要針對中國國情的聾病背景，展開研究試驗(yàn)，探討Sanger測序法與導(dǎo)流雜交技術(shù)在檢測非綜合征性耳聾患者的最常見致病基因GJB2[4]突變情況的差異。根據(jù)本研究成果顯示，Sanger測序法檢測GJB2基因突變的總檢出率為38.78%，致病突變檢出率為19.39%，等位基因檢出率為29.08%；而導(dǎo)流雜交技術(shù)的總檢出率為33.68%，致病突變檢出率為20.00%，等位基因檢出率為26.84%。2種方法學(xué)的檢出率均遠(yuǎn)大于聾病分子流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果，其主要原因：全國性聾病分子流行病學(xué)的調(diào)查主體是面向全國人民，而本次研究材料只針對凱普公司的收檢聾病檢測樣本，檢測對象的群體屬性大有不同。針對本研究課題的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Sanger測序法的總檢出率大于導(dǎo)流雜交技術(shù)（χ2=4.167，P=0.031），其原因主要是：DNA測序“金標(biāo)準(zhǔn)”的Sanger測序法能檢測GJB2基因中第二個外顯子的全部基因組序列，能實(shí)現(xiàn)對該基因組上所有位點(diǎn)的測序檢測，能發(fā)現(xiàn)的未知突變位點(diǎn)更多，檢測范圍更廣[15]，而導(dǎo)流雜交技術(shù)只特異性地針對GJB2基因最常見的5個致病位點(diǎn)突變情況進(jìn)行檢測，相較于測序法，檢測范圍上有較大的局限性，對于在此檢測范圍外的GJB2基因突變無法進(jìn)行識別檢測，因此，對于同一樣本，導(dǎo)流雜交技術(shù)的檢出率的確要比Sanger測序法低。然而，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，出現(xiàn)了導(dǎo)流雜交技術(shù)的致病突變檢出率高于Sanger測序法，其原因可能是：（1）同一樣本量，2種方法學(xué)成功檢出的例數(shù)不同，Sanger測序法為98例，導(dǎo)流雜交技術(shù)只有95例，存在計算基數(shù)的差異，從而導(dǎo)致百分比的計算結(jié)果產(chǎn)生偏差；（2）實(shí)驗(yàn)研究選取的樣本量較少，可能存在GJB2基因致病突變檢測的局限，部分比較罕見的致病突變并沒有在該樣本中體現(xiàn)出來，導(dǎo)致最終2種方法學(xué)在致病突變的檢測例數(shù)相同。因此，下一步的研究方向是適當(dāng)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步驗(yàn)證Sanger測序法在檢測GJB2基因突變的高特異性，才可證實(shí)本次研究中致病突變檢出率的異常緣由。此外，本研究實(shí)驗(yàn)中，通過3組平行實(shí)驗(yàn)設(shè)計，展現(xiàn)了2種方法學(xué)在檢測GJB2基因突變上均具有良好的重復(fù)性。從重復(fù)性結(jié)果可得：Sanger測序法的準(zhǔn)確性（100%）高于導(dǎo)流雜交技術(shù)（90%）。這除了與Sanger測序法的高特異性優(yōu)點(diǎn)存在一定關(guān)聯(lián)，還可能與樣本本身有關(guān)：（1）從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中，不難發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)流雜交技術(shù)檢測不出的2例樣本的純度（A260/280）均小于1.60，濃度也比較低，DNA含量較少，這可能是導(dǎo)致導(dǎo)流雜交檢測失敗的原因；（2）在進(jìn)行PCR擴(kuò)增，加樣前對DNA的震蕩，可能導(dǎo)致了DNA片段化，造成比較差的擴(kuò)增效果，從而影響了雜交結(jié)果；（3）導(dǎo)流雜交之前，需要對DNA進(jìn)行加熱變性，可能加熱時長不夠，導(dǎo)致DNA不完全變性成單鏈，從而出現(xiàn)顯色較弱或雜交結(jié)果無法識別。具體的問題分析解決還需進(jìn)一步設(shè)計實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。從靈敏度的設(shè)計試驗(yàn)的結(jié)果看，在相同的檢測范圍內(nèi)，兩種方法學(xué)的總體可識別率為78.57%。而Sanger測序法檢測結(jié)果的可識別率只有57.14%，遠(yuǎn)小于導(dǎo)流雜交技術(shù)的可識別程度（100%），通過醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)的R×C列聯(lián)表資料χ2檢驗(yàn)，χ2值為15.54，P值為0.001，表明該統(tǒng)計對比具有統(tǒng)計學(xué)意義。導(dǎo)流雜交技術(shù)在DNA濃度為1ng/ul，仍能檢測出突變情況，充分體現(xiàn)其高靈敏的突出優(yōu)點(diǎn)，這在血斑卡或質(zhì)量較差的原始樣本類型提取DNA的聾病檢測上占有較大的優(yōu)勢：一般地，對于常見突變位點(diǎn)檢測的血斑卡樣本，血斑卡上患者提供的血液量遠(yuǎn)小于EDTA-全血樣本，這可能導(dǎo)致提取濃度偏低，該情況下，相對于應(yīng)用Sanger測序可能因DNA含量達(dá)不到檢出限而導(dǎo)致最終檢測失敗，應(yīng)用導(dǎo)流雜交技術(shù)，對特定位點(diǎn)進(jìn)行檢測，能夠彌補(bǔ)樣本DNA質(zhì)量較差的檢測條件對結(jié)果產(chǎn)生的客觀影響。Sanger測序法在DNA濃度為3ng/ul，均檢測不出結(jié)果，主要在于該濃度下，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物DNA的含量仍低于其檢出限。但由于原始樣本量的不足、研究實(shí)驗(yàn)時間上的不允許，該實(shí)驗(yàn)設(shè)計中對濃度稀釋存在著一定的局限，沒有設(shè)計在3ng/ul～5ng/ul區(qū)間的稀釋濃度，故不能判定Sanger測序法的檢出限為5ng/ul。對于Sanger測序法的檢出限還需進(jìn)一步設(shè)計實(shí)驗(yàn)研究。

結(jié)論在針對中國國情的耳聾背景，檢測非綜合征聾病患者常見的致病基因GJB2的突變情況，Sanger測序法與導(dǎo)流雜交技術(shù)對已知和未知突變的檢測均具有良好的重復(fù)性。不同的是：Sanger測序法具有高特異性、高準(zhǔn)確性、高通量的明顯優(yōu)點(diǎn)，能實(shí)現(xiàn)對GJB2基因第二外顯子的所有未知突變位點(diǎn)的檢測，適合于臨床GJB2基因的精確體外診斷。但由于該法操作繁瑣，檢測時間長，實(shí)驗(yàn)成本高，并不適合于大規(guī)模的臨床篩查檢測。相反地，導(dǎo)流雜交技術(shù)的優(yōu)勢在于操作簡便易掌握，檢測周期短，實(shí)驗(yàn)損耗少，并且靈敏度高，適合于臨床上大樣本量的篩查；但由于只針對GJB2基因最常見的5個致病的單位點(diǎn)突變情況進(jìn)行檢測，相較于測序法，檢測范圍上有較大的局限性，對于此范圍外的GJB2基因上的突變無法進(jìn)行檢測。因此，對于遺傳性聾病檢測，可通過導(dǎo)流雜交平臺對最常見的致病突變進(jìn)行篩查，而對于懷疑是稀有突變造成的耳聾，測序法則可以進(jìn)行補(bǔ)充，通過特異性引物自主設(shè)計，能對整個目的片段的序列進(jìn)行檢測，從而發(fā)現(xiàn)并查明相關(guān)的疑似突變，實(shí)現(xiàn)對整個目的DNA片段序列的全面檢測。綜上所述，2種方法學(xué)結(jié)合起來檢測非綜合征聾病患者常見的致病基因GJB2的突變情況，結(jié)果更為可靠、準(zhǔn)確、科學(xué)，實(shí)現(xiàn)了高效率、高準(zhǔn)確性、高靈敏度的臨床診斷，構(gòu)建出更為科學(xué)、合理的聾病基因診斷技術(shù)平臺，進(jìn)而為臨床診斷治療提供安全﹑有效的科學(xué)依據(jù)。

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