考點(diǎn)49基因工程的工具及操作程序（講義）（原卷版）

考點(diǎn)49基因工程的工具及操作程序基因工程的基本工具限制性內(nèi)切核酸酶（簡(jiǎn)稱）——分子手術(shù)刀存在：主要存在于中。作用：識(shí)別DNA分子的特定，并且使每一條鏈中特定部位的斷開。特點(diǎn)：具有。結(jié)果：形成或。原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵。限制酶作為一種防御工具，可切割外源DNA，使之失效，進(jìn)行保證原核生物的安全。原核生物中不存在相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已被修飾，故限制酶不切割自身的DNA。DNA連接酶——分子縫合針（1）作用：連接兩個(gè)DNA片段。（2）主要種類：①：從大腸桿菌中分離得到，只能連接具有互補(bǔ)的DNA片段。②：從T4噬菌體中分離出來(lái)，可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的和雙鏈DNA片段的。T4DNA連接酶雖然兩種末端均能連接，但連接平末端的效率相對(duì)較低。（3）DNA連接酶和限制酶的區(qū)別與聯(lián)系項(xiàng)目類型限制酶DNA連接酶作用使特定部位的磷酸二酯鍵在DNA片段之間重新磷酸二酯鍵應(yīng)用用于目的基因和載體用于目的基因片段與載體的聯(lián)系基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——分子運(yùn)輸車（1）質(zhì)粒：一種、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞或原核細(xì)胞之外，并具有能力的雙鏈DNA分子。（2）其他載體：和等。（3）載體必需的條件（以質(zhì)粒為例）①有一個(gè)至多個(gè)切割位點(diǎn)，供外源DNA片段（基因）插入其中。②能在受體細(xì)胞中進(jìn)行，或整合到上，隨受體DNA同步復(fù)制。③有特殊的，便于重組DNA分子的篩選。易錯(cuò)提醒：工具包括3種：限制酶（限制性內(nèi)切核酸酶）、DNA連接酶、載體；工具酶包括2種：限制酶（限制性內(nèi)切核酸酶）、DNA連接酶。真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蚰康幕虻暮Y選與獲取（1）篩選合適的目的基因①目的基因：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。主要指的基因，如Bt抗蟲蛋白基因。②篩選方法：和清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。如培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉中用到的蘇云金桿菌的Bt抗蟲蛋白基因。b.通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因。（2）利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因①PCR：即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)根據(jù)的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。②條件緩沖溶液維持溶液的pHDNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板2種引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶催化合成DNA子鏈4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料耐高溫的DNA聚合酶——TaqDNA聚合酶。③步驟過(guò)程說(shuō)明圖解變性當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈復(fù)性溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條DNA單鏈結(jié)合延伸72℃左右時(shí)，在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，可使DNA新鏈有5’端向3’端延伸每次循環(huán)一般可以分為三步。目的基因的數(shù)量：目的基因的數(shù)量呈指數(shù)形式增長(zhǎng)，擴(kuò)增循環(huán)n次，DNA的數(shù)量約為2n。儀器：PCR擴(kuò)增儀PCR產(chǎn)物鑒定：常用瓊脂糖凝膠電泳?；虮磉_(dá)載體的構(gòu)建（1）目的：使目的基因在受體細(xì)胞中存在，并且給下一代，同時(shí)使其能夠和作用。（2）基因表達(dá)載體的組成：?jiǎn)?dòng)子、目的基因、終止子、復(fù)制原點(diǎn)以及標(biāo)記基因等。組成功能啟動(dòng)子一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。終止子一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的下游，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)。標(biāo)記基因一般是抗生素抗性基因，還有發(fā)光基因、產(chǎn)生特定顏色的表達(dá)產(chǎn)物的基因等，用來(lái)篩選、鑒別受體細(xì)胞是否含有目的基因。（3）基因表達(dá)載體的構(gòu)建模式圖將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（1）導(dǎo)入植物細(xì)胞常用的方法①法②法a.轉(zhuǎn)化：進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持和的過(guò)程。b.農(nóng)桿菌的特點(diǎn)：農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的上。c.原理：將目的基因插入的中，通過(guò)的轉(zhuǎn)化作用，使目的基因進(jìn)入細(xì)胞。（2）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法①受體細(xì)胞：②常用方法：③程序?qū)⒑心康幕虻谋磉_(dá)載體提純→取卵→獲得受精卵→顯微注射→早期胚胎培養(yǎng)→胚胎移植→發(fā)育成具有新性狀的動(dòng)物（3）導(dǎo)入原核細(xì)胞的方法①方法：②程序【微點(diǎn)撥】【微點(diǎn)撥】Ca2+處理細(xì)胞，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變。目的基因的檢測(cè)與鑒定（1）分子水平的檢測(cè)①檢測(cè)目的基因是否插入或是轉(zhuǎn)錄出mRNA：等技術(shù)。②檢測(cè)目的基因是否翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)：提取受體中的蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行。（2）個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行鑒定，如進(jìn)行。如通過(guò)采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來(lái)確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度。DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)原理DNA不溶于，但某些蛋白質(zhì)溶于，利用這一原理，可初步分離DNA與蛋白質(zhì)。DNA在不同濃度的NaCl溶液中不同，它能溶于的NaCl溶液。DNA+藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)步驟【微點(diǎn)撥】【微點(diǎn)撥】研磨液中的部分成分及功能SDS（十二烷基硫酸鈉）：可使細(xì)胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)變性與DNA分離。EDTA（乙二胺四乙酸）：一種DNA酶抑制劑，防止細(xì)胞破碎后DNA酶降解DNA。Tris（三羥甲基氨基甲烷）：提供使DNA呈穩(wěn)定狀態(tài)的緩沖體系。提取DNA：玻璃棒上卷著的絲狀物是用冷卻的酒精析出的DNA。實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)破碎細(xì)胞應(yīng)徹底、充分。酒精必須經(jīng)過(guò)充分后才能使用。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，攪拌時(shí)玻璃棒直插燒杯底部，并且攪拌要，并沿?cái)嚢枰员惬@得較完整的DNA分子。將絲狀物溶于2mol/L的NaCl溶液中時(shí)，需要不斷攪拌以增加溶解的DNA的量。二苯胺試劑要，否則會(huì)影響鑒定的效果?？挤?基因工程及基本操作程序?qū)蚬こ谈拍畹睦斫饣蚬こ痰膭e名重組DNA技術(shù)操作對(duì)象基因操作水平分子水平原理基因重組優(yōu)點(diǎn)能克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，能定向改造生物性狀幾組概念的辨析黏性末端和平末端（2）限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶等相關(guān)酶的分析比較名稱作用部位作用底物作用結(jié)果限制酶磷酸二酯鍵DNA將DNA切開DNA連接酶磷酸二酯鍵DNA片段將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子DNA聚合酶或耐高溫的DNA聚合酶磷酸二酯鍵脫氧核苷酸將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到DNA單鏈3’末端DNA（水解）酶磷酸二酯鍵DNA將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸解旋酶堿基對(duì)之間的氫鍵DNA將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈RNA聚合酶磷酸二酯鍵和氫鍵核糖核苷酸將單個(gè)核糖核苷酸依次連接到單鏈RNA3’端關(guān)于限制酶的分析切割目的基因和載體時(shí)用同種限制酶的原因：產(chǎn)生相同的黏性末端。也可用不同的限制酶切割，但產(chǎn)生的黏性末端必須互補(bǔ)。作為載體必須具有多個(gè)限制酶切位點(diǎn)，而且每種酶的切點(diǎn)最好只有一個(gè)，原因是一種限制酶一般只能識(shí)別單一酶切位點(diǎn)，若載體上有一個(gè)以上的同種酶切位點(diǎn)，則切割重組后可能丟失某些片段，若丟失的片段含復(fù)制原點(diǎn)，則基因表達(dá)載體進(jìn)入受體細(xì)胞后便不能自主復(fù)制。一個(gè)載體若只有限制酶的一個(gè)酶切位點(diǎn)，則酶切后既能把環(huán)打開以接納外源DNA片段，又不會(huì)丟失自己的片段。要獲取一個(gè)目的基因，需用限制酶剪切目的基因的兩端，共產(chǎn)生4個(gè)黏性末端或平末端。限制酶的選擇依據(jù)①根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點(diǎn)確定限制酶的種類應(yīng)選擇切割位點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，以便將目的基因“切出”，可選擇圖中的PstI。不能選擇切割位點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，以防破壞目的基因，故不能選擇圖中的SmaI。為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因及質(zhì)粒，如圖中的PstI和EcoRI。②根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類③根據(jù)Ti質(zhì)粒的TDNA片段確定限制酶的種類（設(shè)切割目的基因的限制酶為XbaI和SacI）圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取，而丙Ti質(zhì)粒宜選取。（2023?云南二模）下列有關(guān)重組DNA技術(shù)的基本工具的敘述，正確的是（）A．限制酶能夠識(shí)別RNA分子的特定核苷酸序列 B．?dāng)y帶外源DNA片段的質(zhì)?？稍谑荏w細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制 C．DNA連接酶不能連接雙鏈DNA片段的平末端 D．DNA連接酶能連接DNA分子雙鏈堿基對(duì)之間的氫鍵（2023?古冶區(qū)校級(jí)一模）載體是基因工程中攜帶外源DNA片段（目的基因）進(jìn)入受體細(xì)胞的重要運(yùn)載工具，常見(jiàn)的載體類型主要有基因克隆載體和基因表達(dá)載體。如圖是利用細(xì)菌生產(chǎn)人胰島素的基本流程示意圖，下列相關(guān)敘述正確的是（）A．重組載體A、重組載體B分別是基因表達(dá)載體和基因克隆載體 B．載體A和載體B都必須含有限制酶切割位點(diǎn)、復(fù)制原點(diǎn)和標(biāo)記基因 C．必須把目的基因插入重組載體A的啟動(dòng)子和終止子之間 D．培養(yǎng)細(xì)菌A和細(xì)菌B的培養(yǎng)基在營(yíng)養(yǎng)成分和功能上沒(méi)有明顯差異（2023?廈門模擬）如表為四種限制酶所識(shí)別的核苷酸序列及相應(yīng)的切割位置（箭頭所指），下列敘述正確的是（）限制酶種類序列及切點(diǎn)限制酶種類序列及切點(diǎn)①：EcoRⅠ5′﹣G↓AATTC﹣3′3′﹣CTTAA↑G﹣5′③：BglⅡ5′﹣A↓GATCT﹣3′3′﹣TCTAG↑A﹣5′②：BamHⅠ5′﹣G↓GATCC﹣3′3′﹣CCTAG↑G﹣5′④：NotⅠ5′﹣GC↓GGCCGC﹣3′3′﹣CGCCGG↑CG﹣3′A．①②③④可催化磷酸二酯鍵和氫鍵斷裂，形成黏性末端 B．① C．②、③切出的末端連接后形成的片段，不能再被②或③識(shí)別切割 D．構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，用②、③進(jìn)行雙酶切，可防止目的基因與載體的反向連接（2023?杭州模擬）研究人員用EcoRⅠ和SmaⅠ兩種限制酶處理某DNA分子，圖1為EcoRⅠ切割該DNA分子后的結(jié)果；圖2是酶切后的凝膠電泳圖譜，其中1號(hào)泳道是DNAMarker，2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)分別是EcoRⅠ單獨(dú)處理、SmaⅠ單獨(dú)處理、兩種酶共同處理后的電泳結(jié)果。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（）A．據(jù)圖1可知EcoRⅠ的識(shí)別序列為﹣GAATTC﹣，切割位點(diǎn)在G和A之間 B．據(jù)圖2可知瓊脂糖凝膠的加樣孔在B端，且連著電泳槽的負(fù)極 C．據(jù)圖2可知該DNA分子最可能是含1000個(gè)堿基對(duì)的環(huán)狀DNA D．據(jù)圖2可知該DNA分子中兩種限制酶的酶切位點(diǎn)各有一個(gè)（2023?福建模擬）2022年1月7日，馬蘭里醫(yī)學(xué)中心成功將豬心臟移植到一名57歲的心臟病患者身上，雖然這顆心臟僅僅存活了2個(gè)月，但仍然為異種器官移植的可行性提供了可觀的數(shù)據(jù)。為了降低免疫排斥反應(yīng)，研究者借助CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)移植的豬心臟進(jìn)行了基因編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由向?qū)NA（sgRNA）和Cas9蛋白兩部分組成，sgRNA可引導(dǎo)Cas9蛋白到特定基因位點(diǎn)進(jìn)行切割，其機(jī)制如圖所示。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是（）A．若要對(duì)一個(gè)基因進(jìn)行編輯，則通常至少需要設(shè)計(jì)兩個(gè)序列不同的sgRNA B．sgRNA可以特異性識(shí)別目標(biāo)DNA分子，Cas9蛋白作用于磷酸二酯鍵 C．有時(shí)sgRNA會(huì)因錯(cuò)誤結(jié)合而出現(xiàn)“脫靶”現(xiàn)象，一般sgRNA序列越短，脫靶率越低D．為降低免疫排斥反應(yīng)，可通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)敲除相關(guān)抗原蛋白基因（2023?南充模擬）大米中鐵含量極低，科研人員通過(guò)基因工程、細(xì)胞工程等現(xiàn)代生物技術(shù)，培育出了鐵含量比普通水稻高60%的轉(zhuǎn)基因水稻，改良了大米的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。如圖為培育轉(zhuǎn)基因水稻過(guò)程示意圖，其中①～⑥為過(guò)程，EcoRⅠ，HindⅢ，BamHⅠ為限制酶。（1）完成圖中①過(guò)程需選用限制酶處理Ti質(zhì)粒和含目的基因的DNA。（2）②過(guò)程中用處理農(nóng)桿菌，使其成為感受態(tài)細(xì)胞。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理是：在農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上存在片段，它具有可以整合到受體細(xì)胞上的特點(diǎn)，使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞并穩(wěn)定存在和表達(dá)。為了篩檢成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，1號(hào)培養(yǎng)基需要加入。（3）圖中過(guò)程，屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)，該技術(shù)依據(jù)的基本原理（理論基礎(chǔ)）是。（2023?平度市模擬）北極比目魚體內(nèi)有抗凍基因，其編碼的抗凍蛋白具有11個(gè)氨基酸的重復(fù)序列，該序列重復(fù)次數(shù)越多，抗凍能力越強(qiáng)。如圖是獲取轉(zhuǎn)基因抗凍番茄植株的過(guò)程示意圖。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（）A．過(guò)程①獲取的目的基因含有啟動(dòng)子和終止子 B．過(guò)程②涉及磷酸二酯鍵的斷裂與形成 C．農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中T﹣DNA可將抗凍基因?qū)敕鸭?xì)胞 D．抗凍番茄植株中抗凍基因與比目魚體內(nèi)抗凍基因堿基序列可能不同（2023?遼寧二模）為初步探究某動(dòng)物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡(jiǎn)稱phb2基因），大小為0.9kb（1kb＝1000堿基對(duì)），利用大腸桿菌表達(dá)該蛋白。圖1為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)如表，phb2基因序列不含圖1中限制酶的識(shí)別序列。轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌提取質(zhì)粒，再用選中的兩種限制酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，結(jié)果如圖2。下列敘述錯(cuò)誤的是（）相關(guān)限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)（注：箭頭表示切割位點(diǎn)）名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)HindⅢA↓AGCTTTTCGA↑AEcoRⅠG↓AATTCCTTAA↑GPvitⅡCAG↓CTGGTC↑GACPstⅠGA↑CGTCGA↑CGTCKpnⅠG↓GATCCCCATG↑GBamHⅠG↓GATCCCCTAG↑GA．需設(shè)計(jì)特異性的引物通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增phb2基因 B．為使phb2基因與載體正確連接，在擴(kuò)增的phb2基因兩端分別引入KpnⅠ和EcoRⅠ兩種不同限制酶的識(shí)別序列 C．經(jīng)過(guò)兩種限制酶酶切的phb2基因與載體進(jìn)行連接時(shí)，可選用T4DNA連接酶 D．圖2中3號(hào)的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒31．（2023?廣東二模）二倍體馬鈴薯受核糖核酸酶基因（S﹣RNase）影響，普遍存在自交不親和的現(xiàn)象一一自交不產(chǎn)生種子，我國(guó)科研人員通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除了馬鈴薯的S﹣RNase基因，獲得自交親和的二倍體馬鈴薯如圖示該技術(shù)的原理：由一條單鏈向?qū)NA引導(dǎo)內(nèi)切核酸酶Cas9蛋白到一個(gè)特定的基因位點(diǎn)進(jìn)行切割。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．向?qū)NA和S﹣RNase基因識(shí)別結(jié)合的堿基互補(bǔ)配對(duì)方式與目標(biāo)DNA雙鏈中的堿基互補(bǔ)配對(duì)方式相同 B．Cas9蛋白可催化磷酸二酯鍵水解，剪切特定DNA片段 C．可讓馬鈴薯自交看能否產(chǎn)生種子，從個(gè)體水平上檢測(cè)該基因編輯技術(shù)是否成功 D．向?qū)NA的序列越短，該基因編輯技術(shù)在編輯對(duì)象時(shí)出錯(cuò)的概率就越高33．（2023?通許縣三模）研究表明，服用α﹣干擾素在慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤的治療中有一定療效。人參是一種名貴藥材，具有較好的滋補(bǔ)作用。限制酶的發(fā)現(xiàn)為DNA的切割和功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)分別為↓GATC、G↓AATTC、C↓GATCC。含干擾素基因的DNA片段如圖1所示，圖2為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細(xì)胞的流程圖，①～④表示相關(guān)的操作。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：（1）結(jié)合上圖，在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，為克服目的基因和農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因與質(zhì)粒的任意連接等，應(yīng)選擇用限制酶處理含某目的基因的DNA和質(zhì)粒。（2）DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是。（3）圖2操作①常利用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增干擾素基因，除含有干擾素基因的DNA片段之外，該過(guò)程需要提供以及與干擾素基因兩端兩條模板鏈結(jié)合的兩種引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)，為了保證目的基因與質(zhì)粒順利連接，防止出現(xiàn)自身環(huán)化連接，需要在兩種引物的一端分別加上EcoRⅠ和BamHⅠ的識(shí)別序列。（4）圖2步驟②除EcoRⅠ、BamHⅠ兩種酶外，還需要用酶。構(gòu)建的基因表達(dá)載體除含有目的基因片段以外，還必須有，以保證干擾素基因能在人參愈傷組織細(xì)胞中穩(wěn)定存在和表達(dá)。同時(shí)，還應(yīng)含有標(biāo)記基因以便于。（5）圖2操作④常用技術(shù)檢測(cè)干擾素基因是否成功表達(dá)出干擾素?？挤?（實(shí)驗(yàn)）DNA的粗提取與鑒定（2023?上虞區(qū)模擬）關(guān)于“DNA的粗提取和鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列說(shuō)法正確的是（）A．研磨時(shí)倒入的研磨液，是為了破壞細(xì)胞壁 B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀 C．在DNA提取物中加入二苯胺，迅速呈現(xiàn)藍(lán)色 D．提取DNA時(shí)要用玻璃棒沿一個(gè)方向緩緩攪動(dòng)（2023?山東模擬）下列與DNA粗提取和鑒定有關(guān)的敘述，錯(cuò)誤的是（）A．預(yù)冷的酒精容易使DNA析出 B．DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液中 C．若提取出白色絲狀物，說(shuō)明DNA中雜質(zhì)少 D．可用堿性染料甲紫鑒定提取出來(lái)的DNA考法3PCR的基本操作和應(yīng)用物質(zhì)條件引物：PCR所用的引物是一小段單鏈RNA或單鏈DNA，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。DNA復(fù)制之所以需要引物，是因?yàn)镈NA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從引物的3’端延伸DNA鏈。PCR的引物通常由20~30個(gè)核苷酸聚合而成，引物的量需保證滿足幾十次循環(huán)反應(yīng)的需要。DNA聚合酶：PCR中所用的酶是一種從嗜熱菌中分離得到的耐高溫的DNA聚合酶，高溫條件下不會(huì)失活。反應(yīng)體系中加入Mg2+，可以使酶催化的活化能更加降低，使得反應(yīng)能夠進(jìn)行得更加容易。PCR擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較PCR擴(kuò)增DNA復(fù)制不同點(diǎn)場(chǎng)所在體外的反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行在體內(nèi)的活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行解旋方式高溫變性解聚解旋酶解旋擴(kuò)增過(guò)程完全解聚再?gòu)?fù)制，分為變性、復(fù)性（或退火）和延伸三個(gè)步驟邊解旋邊復(fù)制引物DNA或RNARNA結(jié)果短時(shí)間內(nèi)形成大量的DNA片段形成的是整個(gè)DNA分子相同點(diǎn)①都需要DNA模板、DNA聚合酶、引物、四種脫氧核苷酸等成分；②都遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，有解聚和延伸過(guò)程，子鏈延伸的方向都是從5’端到3’端；③都屬于半保留復(fù)制；④結(jié)果都使DNA數(shù)量呈2n的指數(shù)式擴(kuò)增PCR的應(yīng)用分析人的血液，對(duì)細(xì)菌、病毒感染情況進(jìn)行早期診斷。用于遺傳病的基因診斷與基因治療。用于鑒別犯罪嫌疑人、親子鑒定。分析生物化石樣品，追溯其生存年代或遷徙蹤跡。檢測(cè)目的基因是否已經(jīng)插入目標(biāo)生物染色體DNA和目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。PCR產(chǎn)物的電泳鑒定：一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。①電泳概念：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場(chǎng)作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)。②電泳原理：在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。（2023?滄縣校級(jí)模擬）基于聚合酶制造的PCR儀實(shí)際上是一個(gè)溫控設(shè)備，能在變性溫度、復(fù)性溫度、延伸溫度之間很好地進(jìn)行切換，主要過(guò)程如圖所示。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是（）A．實(shí)施上述過(guò)程的前提是已知目的基因的一段核苷酸序列 B．圖中a、b、c過(guò)程控制的溫度由高到低依次是過(guò)程a、c、b C．耐高溫的DNA聚合酶沿著5'→3'的方向合成互補(bǔ)子鏈 D．c延伸過(guò)程中需要緩沖溶液、ATP和四種核糖核苷酸（2023?肥城市模擬）通過(guò)設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)誘變。如圖為基因工程中獲取突變基因的過(guò)程，其中引物1序列中含有一個(gè)堿基T不能與目的基因片段配對(duì)，但不影響引物與模板鏈的整體配對(duì)，反應(yīng)體系中引物1和引物2的5′端分別設(shè)計(jì)增加限制酶a和限制酶b的識(shí)別位點(diǎn)。有關(guān)敘述正確的是（）A．在PCR反應(yīng)體系中還需要加入4種游離核苷酸、解旋酶、Taq酶等B．第2輪PCR，引物1能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長(zhǎng)的突變基因C．引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識(shí)別位點(diǎn)有利于目的基因定向插入運(yùn)載體 D．第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對(duì)且兩條鏈等長(zhǎng)的DNA占（2023?湖北模擬）乳酸乙酯是白酒中重要的呈香物質(zhì)，由乳酸脫氫酶催化產(chǎn)生，影響白酒品質(zhì)和風(fēng)格?？蒲腥藛T將釀酒酵母質(zhì)粒上的丙酮酸脫氫酶基因（PD）替換為植物乳桿菌中的乳酸脫氫酶基因（L﹣PG），可獲得乳酸乙酯高產(chǎn)菌株，該過(guò)程如圖所示。下列說(shuō)法不正確的是（）A．可借助序列數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank）等查詢L﹣PG基因的序列和功能 B．可以利用PCR技術(shù)篩選導(dǎo)入了L﹣PG基因的受體細(xì)胞 C．酵母菌PD基因被替換為L(zhǎng)﹣PG基因的過(guò)程中發(fā)生了基因重組 D．電泳鑒定L﹣PG基因時(shí)，當(dāng)觀察到核酸染料遷移至凝膠邊緣時(shí)，停止電泳（2023?博白縣模擬）細(xì)菌病的防治一直是困擾人類的難題之一，特別是長(zhǎng)期使用抗生素，許多細(xì)菌產(chǎn)生了明顯的耐藥性。通過(guò)基因工程和胚胎工程生產(chǎn)抗菌肽，是研制新型抗菌藥物的有效途徑?；卮鹣铝袉?wèn)題：（1）生產(chǎn)抗菌肽所需的抗菌肽基因，可用技術(shù)大量擴(kuò)增。擴(kuò)增過(guò)程中需要將溫度冷卻至55～60℃，這步叫復(fù)性，目的是。獲得大量抗菌肽基因后，為了使其和質(zhì)粒能正確地成功拼接，一般操作方法是用切割含抗菌肽基因的DNA片段和質(zhì)粒。（2）抗菌肽基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，可利用放射性同位素標(biāo)記的目的基因的DNA片段作為，目的是檢測(cè)。（3）一般科學(xué)家將抗菌肽基因?qū)胧芫?，以培育出能產(chǎn)生抗菌肽的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，請(qǐng)分析選擇受精卵作為受體細(xì)胞的原因是。（4）受精卵在體外培養(yǎng)到早期胚胎過(guò)程中，需用培養(yǎng)液培養(yǎng)。早期胚胎發(fā)育到適宜的時(shí)期再將胚胎移植到代孕母體的子宮里，用這種方法得到的動(dòng)物稱為（填“克隆動(dòng)物”或“試管動(dòng)物”）。（2023?廈門模擬）如圖表示PCR過(guò)程中某個(gè)階段反應(yīng)體系的情況，①②③④表示相關(guān)物質(zhì)，L、R表示方向。下列敘述正確的是（）A．②鏈從L到R的方向?yàn)?′→5′，①②鏈均可作為子鏈合成的模板 B．PCR過(guò)程需要通過(guò)解旋酶斷開氫鍵，且為邊解旋邊復(fù)制 C．以1個(gè)DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)需消耗8個(gè)引物③ D．物質(zhì)③的5′端添加了某序列，至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得該序列的雙鏈產(chǎn)物（2023?濱州二模）巢式PCR是指先后用外內(nèi)引物擴(kuò)增目的基因的方法。其原理為：先以比目的基因大的DNA片段為模板，用外引物（F1，R1）進(jìn)行擴(kuò)增，獲得大量含目的基因的中間產(chǎn)物，再以擴(kuò)增后的中間產(chǎn)物為模板，用內(nèi)引物（F2，R2）擴(kuò)增目的基因，如圖所示。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是（）A．PCR反應(yīng)緩沖液中Mg2+的作用是激活DNA聚合酶 B．與傳統(tǒng)PCR相比，巢式PCR能有效提高產(chǎn)物中目的基因的比例 C．由于和兩套引物都互補(bǔ)的靶序列較少，該技術(shù)可大大提高擴(kuò)增的特異性 D．如果兩套引物一起加入反應(yīng)體系中，外引物的復(fù)性溫度應(yīng)顯著低于內(nèi)引物（2023?大東區(qū)校級(jí)四模）單分子熒光測(cè)序技術(shù)原理如圖所示。某種脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）提供一個(gè)相應(yīng)的脫氧核苷酸連接到DNA子鏈上的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一分子的焦磷酸（PPi），一分子的PPi可以通過(guò)一系列反應(yīng)使熒光素發(fā)出一次熒光，通過(guò)檢測(cè)熒光的有無(wú)可推測(cè)模板鏈上相應(yīng)位點(diǎn)的堿基種類。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是（）A．