分子生物學學習資料：chapter4

4.1參考表4.1內(nèi)容，確定下列限制性內(nèi)切酶切口黏性末端（如果存在）的堿基數(shù)和種類（5’或3’突出）答：編號限制酶種類識別序列黏性末端堿基數(shù)黏性末端種類aAluIAG↓CT0無bBglIIA↓GATCT45cClaIAT↓CGAT25dKpnIGGTAC↓C43eMboI↓GATC45fPvuICGAT↓CG23gNotIGC↓GGCCGC45’4.2為什么需要將DNA連接到載體上再克隆？答：首先因為DNA本身在沒有外界提供能量、酶等條件時，無法完全靠自己進行復制。所以我們必須將它加入到一個能提供復制條件并不斷復制的細胞（或類細胞結構）中，例如細菌、噬菌體。其次，如果單純的將所要復制的DNA注入到寄主細胞（hostcell）中，他會被認定為外來物質(zhì)被解體，所以必須要將DNA插入一個載體，以使DNA能在寄主細胞（hostcell）中正常的復制。4.3試描述將一段DNA片段克隆到質(zhì)粒pBR322的PstⅠ位點的過程？你怎么檢測含有外源DNA的質(zhì)粒？答：將一段DNA片段克隆到質(zhì)粒pBR322的PstⅠ位點的過程：首先，用PstⅠ位點的限制性內(nèi)切酶剪切質(zhì)粒pBR322和外源DNA的PstⅠ位點，使他們產(chǎn)生黏性末端。然后，將剪切后的質(zhì)粒和外源DNA同DNA連接酶一起溫育，使質(zhì)粒與外源DNA聯(lián)結。最后，將DNA混合物轉移到E.coli中，質(zhì)粒在細菌中表達。pBR322包含兩個抗生素抗性基因——氨芐青霉素的抗性基因和四環(huán)素的抗性基因。由于PstⅠ位點在氨芐青霉素的抗性基因上，所以有目的蛋白插入的克隆將不產(chǎn)生有活性的Amp蛋白，會對氨芐青霉素敏感。而所有在四環(huán)素平板上能長成的菌落都是含有完整的抗四環(huán)素基因質(zhì)粒的。所以我們可以用影印平板培養(yǎng)法。在含四環(huán)素的正常平板上長出的菌落，用一種有吸附性的墊子轉移到另一個含有氨芐青霉素的平板上，能在該平板上生長的菌落很可能是空載體，而不能生長的菌落則極可能是重組體。與前一平板對照后可以確定這樣的菌落在前一平板上的位置，即檢測到含有外源DNA的質(zhì)粒。4.4描述如何將一段基因克隆到質(zhì)粒pUC18的BamHI和Pstl酶切位點上，如何找出含有插入基因的陽性克隆。答：pUC18的MCS（multiplecloningsite）中只有一個BamHI位點和一個PstI位點，因此，先用兩種酶BamHI與PstI分別酶切載體和目的基因片斷，切出黏性末端，然后將兩種酶切產(chǎn)物，施以DNA連接酶（DNAligase），使其連接，即可得到重組環(huán)狀DNA（recombinantDNA）。含插入片段的載體的篩選方法：由于pUC18中含有氨芐青霉素，而且還含有l(wèi)acZ’基因，其能合成β-半乳糖苷酶N段的α肽，篩選時使用含有編碼β-半乳糖苷酶的C端基因的宿主細菌，其本身合成的β-半乳糖苷酶沒有活性，但一旦含有未插入片段的pUC18時，即可生成有活性的β-半乳糖苷酶，能夠分解半乳糖，而插入片段后的pUC18，lacZ’基因失活，即使進入到宿主體內(nèi)也無法產(chǎn)生有活性的半乳糖苷酶；利用這一原理，將載體轉移進宿主后，由于pUC仍有抗氨芐青霉素基因，所以，將這些含有載體的宿主培養(yǎng)在含有氨芐青霉素以及X-gal的培養(yǎng)基中，X-gal是一種人工合成的半乳糖苷，當β-半乳糖苷酶切割此物質(zhì)后，其釋放一個半乳糖并且顯色將能合成半乳糖苷酶的菌落染成藍色。于是將宿主細菌培養(yǎng)一段時間后，在培養(yǎng)基上選出白色（未被染色的）菌落，即為含有插入片段載體的宿主所產(chǎn)生的陽性菌落。4.5描述DNA片斷插入Charon4載體的EcoRI位點的步驟：答：Charon4是λ載體中的一種置換載體，把DNA克隆入Charon4中的EcoRI位點的步驟是：1）用EcoRI把Charon4載體切開——在噬菌體DNA中部的三個位點切開，形成兩個“臂”和兩個“填充物”片斷。2）通過凝膠電泳或者超速離心棄掉“填充物”而得到純化的臂。3）在原來填充物的位置插入我們要插入的基因，并把插入基因和兩條臂連起來。盡管兩條臂可能沒有和插入基因相連而使自己連接起來，但是由于兩條臂的長度加起來太短了，不夠12kb，因而無法將其放到噬菌體的頭部。4）將重組ＤＮＡ和病毒Charon4的頭尾以及其他組裝所需要的因子，在體外將他們組裝成為有活性的病毒。接著轉染大腸桿菌，篩選陽性噬菌斑，通過復制產(chǎn)生大量重組DNA克隆并收集。4.6克隆1-kb的cDNA，本章中所討論的載體中，哪些是適用的，哪些是不適用的？為什么？答：由于題目中復制的cDNA長度相對較短，故應選用質(zhì)粒載體，而噬菌體載體、黏粒載體、酵母人工染色體（YAC）載體以及細菌人工染色體（BAC）載體均不適用。4.7要建立一個平均長度為45kb的DNA片段的基因文庫，本章中討論的哪種載體最為合適？為什么？答：因為黏粒載體（Cosmids）能插入的片段大小為40-50kb，故選用黏粒載體最為合適。4.8要建立一個平均長度大于100kb的DNA片段的基因文庫，本章中討論的哪種載體最為合適？為什么？答：由于該片段相對較大，故應選用細菌人工染色體（BAC）載體，因為其可插入的片段最大可達350kb。4.9你已經(jīng)完成了一個用phagemid做載體的cDNA文庫，說明你怎樣從中篩選出感興趣的基因序列。分別說明寡聚核苷酸探針法和抗體識別法。答：寡聚核苷酸探針法：前提是預先知道這個cDNA中基因的序列或者其表達產(chǎn)物的氨基酸序列。若是后者，則可以根據(jù)氨基酸對應的密碼子確定該基因的可能序列情況及基因片斷所來自物種的密碼字偏好性，然后根據(jù)此序列合成寡聚核苷酸探針或簡并探針，從而與cDNA文庫雜交以找到特定的基因?？贵w識別法：前提是需要構建在λgt11phage等里的cDNA文庫（表達文庫），以及針對該特殊基因表達所產(chǎn)生蛋白質(zhì)的抗血清。1）在一個plate上很多λgt11phage被培養(yǎng)，并且在plaque當中釋放出蛋白質(zhì)。2）用nitrocellulose對應位置轉移蛋白質(zhì)并用抗血清檢測。3）有抗體結合的那個plaque可以用被標記的Staphylococcusaureus探測出。4）自顯影的方法確定出那個特殊的plaque，并對應原plate上的λgt11phage。這個方法不需要整個cDNA被克隆，因為抗血清是對抗體混合物可以識別許多該蛋白質(zhì)的部分。4.10怎樣從一個M13噬菌體載體獲得單鏈的克隆DNA？從一個噬粒(phagemid)載體呢？答：1）首先DNA在噬菌體微粒中是單鏈的，但在侵入大腸桿菌后，它轉變?yōu)殡p鏈。這條雙鏈的DNA就是用來進行克隆的。當它被一個或兩個限制性內(nèi)切酶在多個克隆位點后，外來的帶有一致末端的DNA就可以插入。這個重組的DNA接著被轉入宿主細胞，產(chǎn)生大量的具有單鏈重組DNA的噬菌體。而這些噬菌體將被從宿主細胞中轉移出來，然后這些單鏈的克隆DNA可以從培養(yǎng)液中收集出來。2）嗜粒特有的噬菌體和質(zhì)?！，F(xiàn)在很通用的是pBluescript,它擁有多個克隆位點能夠插入lacZ’基因，所以帶有插入物能夠通過X-gal染色（藍白篩選）來區(qū)分。這個載體可以與能夠進行復制的單鏈噬菌體f1（類似于M13）結合。這意味著一個包含重組嗜粒的細胞，如果在f1噬菌體（進行單鏈DNA復制）的幫助下，將會產(chǎn)生大量的單鏈嗜粒DNA，從而可以提取單鏈的克隆DNA。4.11圖解如何創(chuàng)建cDNA文庫。答：如下圖所示創(chuàng)建cDNA文庫的基本步驟，下面依次說明。1）一般使用真核mRNA創(chuàng)建。mRNA經(jīng)過其poly(A)尾部與寡聚（dT）相結合，而從溶液中分離出來。制備的mRNA可以用麥胚軸提取液或者網(wǎng)織紅細胞裂解液進行翻譯后，再有聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測翻譯產(chǎn)物的方法進行檢驗；其質(zhì)量還可以用凝膠電泳進行直接檢測，并通過回收凝膠甬道中特定區(qū)段按分子質(zhì)量對mRNA進行分級分離。用雜交法可以將特異序列從mRNA中分離出來。2）cDNA的合成。第一條鏈的合成是通過向引物，通常為寡聚（dT）的3‘端進行添加脫氧核糖核甘酸，用反轉錄酶來合成mRNA的cDNA拷貝。合成反映可以由示蹤法進行檢測。用末端轉移酶對cDNA第一鏈的3’端進行加尾很容易合成出全長的第二鏈。反轉錄酶或Klenow酶都可以與同聚物尾部退火配對來延伸引物。3）cDNA末端的處理。為了避免cDNA與載體間的平末端連接，通常用單鏈特異性核酸酶對cDNA末端進行處理，再用Klenow酶補平后加上接頭。為避免當添加的接頭被限制酶降解時cDNA被酶解?？梢栽谔砑忧皩DNA進行甲基化處理。連接分子也可以用做接頭的替代物。4）與載體的連接。載體通常被堿性磷酸酶去磷酸化以防止自連接，結果會促進重組分子的形成。質(zhì)粒或噬菌體載體可以用于建cDNA文庫，而噬菌體λgt11最適合于用作構建表達文庫的載體。以上過程也可以用如下的簡明流程圖進行表示：Fig4.11cDNA文庫構建示意圖。4.12用圖表說明切口平移（nicktranslation）的過程。答：首先用適當濃度的DNA酶Ⅰ（DNAseⅠ）在DNA雙鏈上造成缺口，然后再借助于DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymeraseⅠ）的5’→3’的外切酶活性，切去帶有5’磷酸的核苷酸；同時又利用該酶的5’→3’聚酶活性，使互補核苷酸補入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的這兩種活性的交替作用，使缺口不斷向3’的方向移動。過程見下圖：Fig4.12切口平移（nicktranslation）示意圖。4.13概述如何利用PCR技術擴增一段給定的DNA片段。答：1）模板DNA的變性：將給定的DNA片段經(jīng)加熱至95℃左右一定時間后，雙鏈變單鏈，以便與引物結合；2）模板DNA與引物的復性：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至50℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；3）引物的延伸：將溫度固定在72℃左右，加入反應原料，在TaqDNA聚合酶的作用下復制合成與原給定片段相同的雙鏈DNA；4）以新合成的DNA片段為模板，重復循環(huán)變性—復性--延伸三過程，就可以以指數(shù)速度擴增DNA片段。4.14比較反轉錄PCR（RT-PCR）和常規(guī)PCR之間有什么不同？RT-PCR的主要應用目的是什么？答：ReversetranscriptasePCR(RT-PCR)StandardPCR原理RT-PCR是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。利用模板變性，引物退火和引物延長的多個循環(huán)來擴增DNA序列。應用對基因轉錄產(chǎn)物進行定性與定量的檢測，相對傳統(tǒng)的檢測方法，如Northern雜交、斑點雜交（RNAdot）等而言，RT—PCR的精確度更高，且樣品用量顯著減少。利用RT—PCR對難檢測的基因進行相應的檢測與研究更易獲得成功。另外，還能同時分析多個差別基因的轉錄。在植物方面，RT—PCR常常用于研究環(huán)境脅迫對植物基因表達的影響，以及在特定的環(huán)境或生長階段中植物體不同部位基因表達的差異性。對基因轉錄中剪切與拼接的檢測：如果RT—PCR引物確定了mRNA片段，根據(jù)其是否包含某個外顯子，將產(chǎn)生兩種差別DNA片段，進而在凝膠電泳圖譜上顯示出遷移率不同的條帶。因為轉座子涉及到特定的DNA序列及轉座酶識別位點，用RT—PCR方法可以較精確地研究轉座過程的分子機制。

聚合酶鏈式反應（PCR）過程這是一個指數(shù)增長的過程，上一輪的擴增產(chǎn)物又作為下一輪擴增的模板，使其成為檢測核酸的一種非常靈敏的技術。一般，經(jīng)過20-30個循環(huán)得到的擴增產(chǎn)物就足夠在溴化乙錠染色的凝膠上觀察到。步驟首先經(jīng)反轉錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉錄反應可以使用逆轉錄酶，以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應產(chǎn)物進行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉錄和PCR在同時為逆轉錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進行。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，引物的選擇隨機引物：適用于長的或具有發(fā)卡結構的RNA。適用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反轉錄反應。主要用于單一模板的RT-PCR反應。OligodT：適用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的OligodTrRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于OligodT要結合到PolyA尾巴上，所以對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，即使有少量降解也會使全長cDNA合成量大大減少?；蛱禺愋砸铮号c模板序列互補的引物，適用于目的序列已知的情況。SuperScriptOne-StepSystem特別適合于與基因特異性引物連用。1.典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。

2.選擇GC含量為40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。

3.設計5'端和中間區(qū)為G或C的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。

4.避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。

5.避免3'末端富含GC。設計引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T。

6.避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。

7.避免存在可能會產(chǎn)生內(nèi)部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩(wěn)定性。4.15一種載體可以產(chǎn)生末端帶有低聚組氨酸的融合蛋白，請描述其用途。并用圖示表示在蛋白提純過程中，低聚組氨酸標簽的優(yōu)點。答：融合蛋白的低聚組氨酸區(qū)域對鎳等金屬有著非常強的親和性，所以帶有低聚組氨酸的蛋白可以用含鎳的親和層析柱進行純化，這種純化方法既簡便又快速。當含有重組DNA的細菌產(chǎn)生融合蛋白后，只需溶解細胞體，將提取液加入鎳親和層析柱，洗掉未連接的蛋白，再用組氨酸或是組氨酸的類似物咪唑洗下融合蛋白即可。因為帶有低聚組氨酸的天然蛋白質(zhì)非常稀少，所以用這種方法可以非常有效的提純插入基因所表達的蛋白。該過程入下圖：并且，從圖示可以看出，當含有低聚組氨酸的融合蛋白被洗下后，可利用腸激酶切掉低聚組氨酸部分，則可得到所需的蛋白。腸激酶的識別位點非常稀少，所以可以保證目標蛋白其余部分不會被切掉。再將經(jīng)酶處理后的蛋白通過層析柱，可將目標蛋白分離。所以該方法十分簡便有效。Fig4.15含低聚組氨酸的融合蛋白的鎳柱親和純化過程。4.16λ插入型載體與λ取代型載體之間的區(qū)別是什么？它們各自的優(yōu)點是什么？答：1）區(qū)別：λ插入型載體（λinsertionvectors），即只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點的λ載體。λ插入型載體只能承受較小分子量（一般在10kb以內(nèi)）的外源DNA片段的插入，廣泛應用于cDNA及小片段DNA的克隆。而λ替換型載體（λreplacementvectors）是一類在λ噬菌體基礎上改建的、在其中央部分有一個可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆載體。λ替換型載體則可承受較大分子量的外源DNA片段的插入，所以適用于克隆高等真核生物的染色體DNA

2）各自優(yōu)勢：λ插入型載體：外源的DNA克隆到插入型的λ載體分子上，會使噬菌體的某種生物功能喪失效力，即所謂的插入失活效應。插入型的λ載體又可以分為免疫功能失活的和大腸桿菌β-半乳糖苷酶失活的兩種亞型。因此，雖然λ插入型載體只能承受較小分子量的外源DNA片段的插入，但是它在檢測重組DNA形