公司培訓液相色譜教程

主要內容一、高效液相色譜法簡介二、高效液相色譜系統(tǒng)三、高效液相色譜法分類四、HPLC使用注意事項高效液相法色譜簡介高效液相色譜法的發(fā)展高效液相色譜法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)起始于60年代后期，是在經(jīng)典液相色譜法的基礎上引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的一種分離分析方法。HPLC法的分離原理溶于流動相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時，與固定相(stationaryphase)發(fā)生吸附、分配、離子交換、排阻等作用，由于不同組分理化性質不同，與固定相發(fā)生作用的大小、強弱不同，導致在固定相中滯留時間不同，從而先后流出色譜柱。高效液相色譜儀的結構流程高壓泵進樣器檢測器色譜工作站色譜柱高效液相譜系統(tǒng)輸液泵

輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。輸液泵應具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其RSD應＜0.5%；②流量范圍寬，分析型應在0.1~10ml/min范圍內連續(xù)可調，制備型應能達到100ml/min；③輸出壓力高，一般應能達到150~300kg/cm2；④液缸容積??；⑤密封性能好，耐腐蝕。一個輸液泵只能控制一個輸液瓶，即只能用一種溶劑（單一或混合溶劑）進行洗脫（等度洗脫）。由于等度洗脫用的流動相組成始終保持恒定，所以只適合組分數(shù)目少，性質差別不大的樣本的分離。一元泵系統(tǒng)

對于組分多、性質差別大的復雜樣本在一個條件下難以將各個組分洗脫下來，如在一個分析周期內按程序改變流動相的組成（如極性、離子強度和pH值)，使各組分在適當條件下得到分離。二元泵系統(tǒng)

在一個分析周期內依據(jù)被測組分的極性而按程序改變流動相組成進行洗脫的方法叫做梯度洗脫。優(yōu)點：能縮短分析時間，提高分離度，改善峰形。缺點：基線漂移。在不同儀器或色譜柱上較難重現(xiàn)。高壓/低壓梯度洗脫系統(tǒng)及特點由兩臺以上輸液泵將兩種以上溶劑分別送入混合器混合，然后進入色譜柱的洗脫方式稱為高壓梯度洗脫。特點：梯度準確度好。由一臺輸液泵通過比例閥和在線脫氣機完成的梯度洗脫方法稱為低壓梯度洗脫。特點：需要配備在線脫氣機，易發(fā)生時間滯后效應?，F(xiàn)在的HPLC輸液泵多用柱塞往復泵，它的液缸容積可小至0.1ml，易于清洗和更換流動相，特別適合于梯度洗脫，而且由于改變電機轉速就能方便地調節(jié)流量，所以流量不受柱阻影響，輸液泵壓力可達400kg/cm2。其主要缺點是輸出的脈沖性較大，雙泵系統(tǒng)較好地克服了輸出脈沖性較大的缺點。按雙泵的連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好（RSD為0.1%左右，串聯(lián)泵為0.2~0.3%），但出故障的機會較多（因多一單向閥），價格也較貴。溶劑的純度要高，否則重現(xiàn)性差；梯度混合的溶劑互溶性要好；進樣之前必須進行空白梯度洗脫，以辨認溶劑峰；每次梯度洗脫之后要對色譜柱進行充分的平衡，使之回到流動相組成的初始濃度。示差折光檢測器對流動相組成變化敏感，不能進行梯度系統(tǒng)。梯度洗脫注意事項檢測器檢測器是HPLC儀的三大關鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉變?yōu)殡娦盘枴８鶕?jù)檢測原理可將其分為選擇性檢測器和通用型檢測器。檢測器選擇性紫外(VWD、DAD)熒光電化學通用型示差折光蒸發(fā)光散射質譜幾種常用檢測器的主要性能UV熒光電化學質譜蒸發(fā)光信號流速影響溫度影響檢測限(g/ml)池體積(μl)梯度洗脫樣品破壞吸光度無小10-102~10適宜無熒光強度無小10-132~7適宜無電流有大10-13＜1不宜無離子流強度無––適宜有散射光強無小10-9––適宜無檢測器的保養(yǎng)紫外燈的保養(yǎng)：分析前，柱平衡差不多時打開檢測器，20分鐘后可以進行檢測；在分析完閉后，先關紫外燈。（頻繁的開關燈會縮短燈的使用壽命）樣品池要常清洗柱溫箱HPLC分析一般在室溫條件下進行,但適當提高柱溫能降低流動相黏度和柱前壓，有利于改善傳質和提高分析速度，有利于提高保留時間的重現(xiàn)性。高效液相色譜分類方法與特點

HPLC分類根據(jù)固定相可以分為：液-固色譜、液-液色譜及鍵合相色譜；根據(jù)分離原理可以分為：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、離子對色譜、排阻色譜等。鍵合相色譜分離原理：認為吸附、分配兼有之。正相色譜：采用極性固定相（如硅膠、氨基與腈基鍵合相），流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入甲醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節(jié)組分的保留時間。用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。反相色譜：一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。

離子交換色譜：固定相是離子交換樹脂。緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。

改變流動相的pH值和離子強度可以改善分離。排阻色譜法

固定相為有一定孔徑的多孔性填料。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。離子對色譜法主要用于分析離子強度大的酸堿物質。分析堿性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強的離子對。分析酸性物質常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。反相離子對色譜法常用ODS柱，流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內進行分離。被測組分保留時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關。三、HPLC使用注意事項HPLC的日常操作條件最好是恒溫、恒濕溫度：15~30℃

相對濕度<80%房間應有良好的通風空調或其他設備產(chǎn)生的氣流不要直吹儀器避免光線直射遠離高電干擾、高振動設備

（一）啟動前檢查

1.流動相是否過濾2.水與有機溶劑混合時溫度變化大，必須待恢復到室溫時方可使用，否則易產(chǎn)生氣泡。3.更換流動相時注意兩種流動相必須具有互溶性，更換溶劑的一般方法：（1）取少量準備更換的流動相放在清潔的燒杯中，取出吸濾器，將吸濾頭放在燒杯中用超聲波振蕩器振動清洗干凈；（2）打開排液閥，按清洗鍵（purge），用新流動相清洗泵中的流動相；（3）關閉排液閥，啟動泵，清洗流路；（4）連接色譜柱和檢測器，用新流動相平衡色譜柱。4.更換不互溶性流動相時應先用異丙醇進行置換，然后每步都按（1）~（4）進行。5.更換緩沖鹽流動相時，用純水清洗，每步都按1~4進行。6.保持貯液瓶清潔，對專用貯液瓶應定期清洗；用試劑瓶作貯液瓶時，要經(jīng)常更換。7.定期在稀硝酸溶液中超聲、清洗過濾器，保持過濾器暢通無阻。8.每天開始使用儀器時注意放空排氣，確保泵頭、流動池以及其它流路系統(tǒng)中無氣泡存在。開機或更換流動相時應從0.2ml/min開始，待壓力穩(wěn)定后再升高流速，每次0.2ml（二）泵的使用與維護注意事項1.防止任何固體微粒進入泵體（0.2um或0.45um的微孔濾膜過濾）。2.流動相應先脫氣，以免在泵內產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性。3.流動相不應含有任何腐蝕性物質，含有緩沖液的流動相不應保留在泵內。4.泵工作時防止溶劑瓶內的流動相用完，否則空泵運轉會磨損柱塞、密封圈，導致漏液。5.輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形造成漏液。6.使用緩沖液后用兩通管連接管路及檢測池，先用純水沖洗，然后用甲醇沖洗。管路及檢測池沖洗干凈后再沖洗色譜柱。反相柱先用含5%~7%甲醇的水沖洗色譜柱（此時不要再連接檢測池），然后用甲醇或甲醇-水混合液沖洗。7.緩沖鹽不得在色譜柱中過夜。8.緩沖液使用前必須過濾。9.磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液易受到細菌和霉菌的影響，不得放置過夜，應臨用現(xiàn)制。注意：用緩沖液后不能直接換用有機溶劑流動相的貯存流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯容器中，不能貯存在塑料容器中。容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。容器應定期清洗，以除去底部的雜質沉淀和可能生長的微生物。1.使用流動相溶解樣品--減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時尤為重要

--保證樣品在流動相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中尤其在柱中產(chǎn)生沉淀2.進樣前最好使用<0.45um的膜進行過濾。樣品處理

手動進樣閥操作注意點：1）樣品溶液必須用0.45um的濾膜過濾2）進樣應使用液相色譜專用平頭進樣針3）轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在進樣閥的中間位置4）常用密封墊的材質適用pH<10,樣品溶液pH小于10,換特氟隆材質的密封墊pH10-135）每天分析工作結束后，要清洗進樣閥定子轉子針頭密封墊彈簧不銹鋼套進樣閥的保養(yǎng)色譜柱的保養(yǎng)8945612370xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx00000000LC-10AD:::::::輸液時不要打開排液閥柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動當柱子和色譜儀聯(lián)結時，閥件或管路一定要清洗干凈要注意流動相的脫氣避免使用高粘度的溶劑作為流動相進樣樣品要提純控制絕對進樣量加預柱預柱預柱套預柱芯

預柱套預柱芯裝色譜柱時應按色譜柱上的箭頭方向安裝。一般不要倒沖色譜柱。每天工作結束后用適當?shù)娜軇﹣砬逑粗?清洗后塞住兩頭當分析柱長期不使用，應用適當有機溶劑保存注意：只能使用色譜級的溶劑!

不能使用舊的或未經(jīng)過濾的緩沖溶液流動相的選擇采用“HPLC”級溶劑對試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測器相匹配（質譜、ELSD不能用無機鹽緩沖液、用UV檢測器時注意溶劑的截止波長分析過程中常見故障

及解決方法被污染的溶劑吸濾頭產(chǎn)生的問題故障特征：“鬼峰”保留時間不斷改變(由于過濾頭堵塞或部分堵塞)清洗步驟：1.水；2.稀硝酸； 3.水；4.異丙醇；5.水注意：砂芯式濾頭不能超聲流路中形成氣泡引起的問題改變保留時間和峰面積

由于流動相中形成氣泡對液流的不良影響及泵中形成氣泡使液流波動峰變形柱中氣泡形成和累積使流動相繞流尖峰或鋸齒狀噪聲檢測池中氣泡形成和累積產(chǎn)生基線噪聲輸液泵常見故障及相應排除措施故障

可能原因

解決辦法

無流動相流出，又無壓力指示泵內有大量氣體打開泄壓閥，排液密封圈損壞更換壓力和流量不穩(wěn)有氣泡打開泄壓閥排液單向閥內有異物稀硝酸超聲清洗壓力高堵壓力低漏按規(guī)則操作盡量避免問題

如出現(xiàn)問題應盡快預測可能出現(xiàn)的問題的原因，一次僅改變一種因素有助于正確判斷問題所在的原因對自己所做的故障排除工作作好記錄!使用HPLC時注意氣相色譜法簡介一、色譜知識簡介二、氣相色譜儀器簡介主要內容氣相色譜知識簡介

GC:用氣體作為流動相的色譜法，利用物質的沸點、極性及吸附性質的差異來實現(xiàn)混合物的分離優(yōu)點:選擇性高、分離效率高、靈敏度高、分析速度快缺點:僅適于蒸汽壓低,沸點低的樣品GC分類：按色譜柱分：填充柱GC和開管柱GC（毛細管柱）按固定相分：氣固色譜和氣液色譜按分離機理分：分配色譜和吸附色譜按進樣方式分：常規(guī)色譜，頂空色譜和裂解色譜等

1.氣固色譜：吸附機理；如永久性氣體：CO、CO2、N2、O2等。

2.氣液色譜：分配機理；適用于較低分子量和低沸點且350℃不易分解的物質組分的分離分析。，另外對于難揮發(fā)的物質可以采用衍生化法使其沸點降低，如高級醇、高沸點酸可以通過酯化使其生成對應的酯。氣相色譜儀的基本配置簡介氣路系統(tǒng)進樣系統(tǒng)色譜柱系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)氣路系統(tǒng)氣源鋼瓶／發(fā)生器氣路控制系統(tǒng)減壓閥流量調節(jié)器氫氣和氮氣不允許用完，當瓶內壓力低于500kPa時即應停止使用。氣體流路連接凈化管，管中可以裝填5A分子篩，以便吸附氣源中微量水和低分子量的有機雜質。在管內5A分子篩之后裝入少量變色硅膠。當分子篩失效不能吸收水分時，水開始被變色硅膠吸收，硅膠由藍變紅說明分子篩需要重新活化。5A分子篩的活化方法是在500一600℃(不應超過600℃)加熱2—3h，或在真空下130℃加熱1h。變色硅膠在120℃加熱活化。凈化管入口和出口應加標志，出口應當用少許紗布、脫脂棉輕輕塞上，嚴防凈化劑粉塵流出凈化管吹進色譜儀。有時在凈化管里還加入活性炭，以吸附分子量較大的有機雜質。進樣系統(tǒng)進樣口汽化室（<400℃，死體積小，惰性）進樣方式手動進樣