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文檔簡介
07.080CCS
4435 DB35/T
實驗用秀麗隱桿線蟲飼育技術(shù)
Caenorhabditis
202
DB35/T
2023目次前言
.................................................................................
II
范圍
...............................................................................
.....................................................................
術(shù)語和定義
.........................................................................
人員
...............................................................................
環(huán)境與設(shè)施
.........................................................................
引種與保種
.........................................................................
繁育
...............................................................................
飼養(yǎng)
...............................................................................
.....................................................................
10
廢棄物處理
........................................................................
11
記錄與檔案
........................................................................
儀器設(shè)備及耗材
......................................................
培養(yǎng)基及試劑
........................................................
.......................................
11
線蟲的生長周期
.....................................................
13
的培養(yǎng)
........................................................
14
..........................................
15參考文獻
.............................................................................
16DB35/T
2023前 言本文件按照GB/T
1.1—2020《標準化工作導則 第1部分:標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定DB35/T
2023實驗用秀麗隱桿線蟲飼育技術(shù)
GB/T
GB
34791—2017
JG/T
秀麗隱桿線蟲 Caenorhabditis
elegansCaenorhabditis大腸埃希氏菌
OP50 Escherichia
coli
E.
coli
Caenorhabditis
Caenorhabditis
elegans
DB35/T
2023按照GB/T
布局
飼育區(qū)
DB35/T
2023
應選取L1幼蟲期線蟲或耐受期線蟲進行長期保種。
溫度低于﹣80
凍存液選用
緩沖液
B;
600~1
只線蟲,每支凍存管中分裝
mL;
凍存管梯度降溫完成后轉(zhuǎn)移至﹣80
凍存24
皿中觀察,復蘇后的線蟲存活率應高于20%。
在﹣80
雄蟲DB35/T
2023
體中的比例為1‰~3‰。為獲取足夠的交配雄蟲,宜將L4幼蟲期線蟲中的雌雄同體線蟲置于30
℃條件
雄蟲和雌雄同體的比例按為
2∶1;
22
整體外觀符合線蟲的顯微形態(tài)學表型(附錄
L4
L4
線蟲以大腸埃希氏菌
OP50(以下簡稱
E。每1
cm
每1
cm
OP50-NGM
cm、
2
液體飼養(yǎng)應用
s~5
生長溫度在
15
20
40%~80%;光照不超過
30
lx;DB35/T
2023蕩頻率為
100
r/min。
易感染的微生物和寄生蟲見附錄F。
產(chǎn)生的生物廢棄物和污水按照SN/T
4835的規(guī)定進行無害化處理,其他實驗室廢棄物按照相關(guān)規(guī)定
DB35/T
2023
搖床材質(zhì)無毒、無害、無放射性。配有溫度控制系統(tǒng),能夠在10
℃溫度范圍內(nèi)調(diào)節(jié)箱內(nèi)溫
r/min~300
r/min。
高壓滅菌鍋材質(zhì)耐熱、耐腐蝕、無放射性,最高滅菌工作溫度不低于130
移液器
酒精燈
挑蟲器
﹣80
提供﹣80
液氮罐A.2
培養(yǎng)皿DB35/T
2023
多孔板
三角瓶無毒、無害、無放射性、耐腐蝕、無菌。常用規(guī)格有50
mL、150
mL、1
000
mL等。
提供每分鐘降低1
凍存管用于﹣80
DB35/T
2023
B.1
GB/T
B.2
LB
LB
g胰蛋白胨,0.5
g酵母粉,1
g氯化鈉(NaCl),加入雙蒸水定容至100
mL,121
C、0.107
滅菌20
min。
LB
MPa滅菌20
B.3
2.5
g酪蛋白胨,17
g瓊脂粉,3
NaCl,加入975
mL的雙蒸水,121
C、0.107
MPa滅菌20
min。冷卻至55
℃后,加入下列溶液(膽固醇溶液過濾除菌,其余溶液在121
C、0.107
MPa
滅菌20
min)。
mL
2
mL
4
24
2HPO4
B.4
M9
g磷酸氫二鈉(Na2HPO4),3
24
NaCl,0.25
g七水硫酸鎂(MgSO47H2O),加入雙蒸
滅菌20
B.5
B.5.1
S緩沖液1
mL
24,871
0.05
KH2PO4
MPa滅菌20
min。
700
mL
DB35/T
20235.85
NaCl,1
24,6
KH24,加入999
mL的雙蒸水,121
C、0.107
MPa滅菌20
min,再加入1
mL
1.86
二胺二鈉(EDTANa2,0.69
亞鐵(FeSO47H2,0.2
(MnCl22O),0.29
g七水硫酸鋅(ZnSO42O),0.025
42
000
MPa滅菌20
S-basal基礎(chǔ)培養(yǎng)液,10
mL
pH
6.0檸檬酸鉀溶液,10
mL微量金屬溶液,3
CaCl2
mL
4
MPa
DB35/T
2023
C.1
DB35/T
2023
DB35/T
2023
幼蟲:在22
℃的培養(yǎng)條件下,野生型秀麗隱桿線蟲產(chǎn)出的卵經(jīng)過大概9
h即孵化成L1。線蟲的幼蟲分為4個階段,分別為一齡、二齡、三齡及四齡幼蟲(L1,L2、L3、L4)。從L1發(fā)育至L4需經(jīng)歷三次蛻
DB35/T
2023
線蟲是以O(shè)P50為食,OP50具有尿嘧啶缺陷,在NGM培養(yǎng)皿上不可無限生長。LB液體培養(yǎng)基即能滿足
mL
于37
℃搖床過夜振蕩培養(yǎng)(220
℃保存4周。OP50的質(zhì)量控制:每批次擴增的OP50均進行一次質(zhì)量檢測。質(zhì)量符合如下要求:OP50菌落呈圓形,微生物
Bacillus
thuringiensis
Drechmeria
coniospora
Leucobacter
Verde
1
Leucobacter
Verde
2www.bPseudomonas
寄生蟲
Nematocida
parisii
Nematocida
displodere被感染的線蟲在顯微鏡下會呈現(xiàn)出特定的表型,能以此來判斷線蟲是否被感染。微生物種屬鑒定參照16S核糖
DB35/T
2023
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