一種實(shí)時(shí)測定反應(yīng)產(chǎn)物對映體過量的新方法

一種實(shí)時(shí)測定反應(yīng)產(chǎn)物對映體過量的新方法

1柱前衍生法nmr法在合成或分離過程中，實(shí)時(shí)檢測映射單元的錯(cuò)誤e.e。這對于優(yōu)化進(jìn)程條件和確定反應(yīng)結(jié)論非常重要。目前,e.e.實(shí)時(shí)檢測方法主要有手性色譜法(手性固定相、手性流動相添加劑,柱前衍生法)與核磁共振(NMR)法。手性色譜法雖被證實(shí)是檢測e.e.最為可靠的方法,且較方便,但手性固定相或流動相添加劑價(jià)格昂貴,且對被分析對映體結(jié)構(gòu)有較高要求。一些結(jié)構(gòu)簡單的對映體(低級醇、酯等),在目前的手性色譜中尚未得到令人滿意的分離。盡管通過柱前衍生法可使其在手性色譜上得到拆分,然而衍生試劑的篩選、繁瑣的過程以及定量分析的準(zhǔn)確性等限制了其在實(shí)時(shí)檢測e.e.過程中的應(yīng)用。NMR法除了儀器本身造價(jià)昂貴外,還需要引入外源手性試劑,增加了實(shí)時(shí)檢測過程的工作量。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展,旋光檢測器(PD)已經(jīng)能夠滿足高效液相色譜(HPLC)靈敏度以及體積要求,使其作為HPLC的新型檢測器,在手性技術(shù)中發(fā)揮了重要作用。HPLC-UV-PD已開始越來越多地用于對映體定性檢測,且已被用于少數(shù)對映體e.e.定量實(shí)時(shí)檢測。但該法將UV與PD兩種檢出限、靈敏度與線性范圍均有較大差異的檢測器串聯(lián)使用,不僅對進(jìn)樣量要求嚴(yán)格,還會使柱外效應(yīng)增加;UV的引入要求被分析物須有較強(qiáng)紫外吸收,否則靈敏度不高;更重要的是,該法必須用待測手性物的單一對映體純品配制一系列確定e.e.的樣品,經(jīng)HPLC-UV-PD檢測后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,再用內(nèi)插法得出待測樣品的e.e.,使得檢測過程繁瑣。尤其是在新手性物研發(fā)過程中,單一對映體純品不可能得到,因此該法很難成為一種通用檢測法。根據(jù)一定檢測條件下,單一對映體旋光度與其濃度成正比的基本性質(zhì),根據(jù)反應(yīng)方程式定量關(guān)系并利用HPLC-PD,本研究建立了一種非手性色譜實(shí)時(shí)檢測對映體e.e.的新方法,并與常規(guī)檢測方法做了對比,證實(shí)了該方法簡便、可靠以及適用范圍廣,有望成為實(shí)時(shí)檢測e.e.的通用方法。2不同濃度中c、n、p含量的合成法測定旋光峰面積的求取以外消旋體(R,S)-C的化學(xué)或酶促拆分為例,其反應(yīng)通式可表示為:利用非手性色譜與常規(guī)HPLC檢測器(UV、FLD等)聯(lián)用,通過流動相與流速的優(yōu)化,可在色譜工作站上分別得到體系中物質(zhì)C、B、CB3種物質(zhì)的響應(yīng)信號,但卻無法辨別其中的(R)-C和(S)-C,這也是非手性色譜本質(zhì)所決定的。但如果將非手性HPLC與PD聯(lián)用,依據(jù)反應(yīng)方程式定量關(guān)系,經(jīng)過計(jì)算,可以準(zhǔn)確得知反應(yīng)通式(1)中C以及CB的e.e.。根據(jù)旋光度計(jì)算公式α=[α]tλλt×c×l可知:當(dāng)測試環(huán)境(光源、溫度,光程)不變時(shí),在一定濃度范圍內(nèi),[α]tλλt為常數(shù),單一對映體旋光度α僅為一個(gè)與其濃度c成正比的物理量,則同時(shí)存在(R)-CB與(S)-CB的樣品(若(S)-CB較(R)-CB占優(yōu)),其旋光度α與(cS-cR)成正比,經(jīng)HPLC-PD檢測,得到工作站上的一個(gè)信號點(diǎn),所有信號點(diǎn)連接在一起,即為旋光峰。設(shè)N為反應(yīng)起始時(shí)(R,S)-C的加入量(mol),X為t時(shí)刻C的總轉(zhuǎn)化率;XR為t時(shí)刻(R)-C的轉(zhuǎn)化率。根據(jù)反應(yīng)方程式可得:t時(shí)刻CB總量為N×X,(R)-CB的量為0.5N×XR,則(S)-CB的量為N×X-0.5N×XR,此時(shí)反應(yīng)體系體積為V0。若A為t時(shí)刻從反應(yīng)體系抽取樣品中CB的旋光峰面積;AS為標(biāo)樣(S)-CB的旋光峰面積(樣品與標(biāo)樣注射量相同,都為V1)。則:其中,MCB為CB分子量,ρCB為CB密度。MCB與ρCB為CB物性參數(shù);N通過反應(yīng)初始加料量計(jì)算出;X為C的總轉(zhuǎn)化率,可以通過液相色譜、氣相色譜或其他方法檢測;V0為取樣時(shí)反應(yīng)體系總體積,可以直接測量,對于某些反應(yīng)體系,可將其近似看成理想溶液,因而反應(yīng)體系總體積V0為體系中各組分體積之和;旋光峰面積A與AS由HPLC-PD檢測得出。數(shù)據(jù)代入方程(2)后即可解出XR。因此,反應(yīng)過程中任意時(shí)刻C與CB的e.e.即可通過下式算出:由此可知,只要過程中檢測條件保持一致,該法就能迅速獲得反應(yīng)體系任意時(shí)刻樣品中各對映體e.e.,且對被分析物結(jié)構(gòu)沒有任何要求,適用范圍較廣。3檢測方法的驗(yàn)證以豬胰脂肪酶(PPL)催化酯交換動力學(xué)反應(yīng)拆分(R,S)-2-甲基-1-丁醇為例,通過2個(gè)對比實(shí)驗(yàn)證實(shí)檢測方法的準(zhǔn)確性與可靠性。反應(yīng)原理為:(R,S)-2-甲基-1-丁醇+乙酸乙烯酯?→豬胰脂肪酶(S)?→豬胰脂肪酶(S)-乙酸異戊酯+(R)-2-甲基-1-丁醇+乙醛3.1高效液相色譜法(S)-2-甲基-1-丁醇(99%,Fluka公司);(R,S)-2-甲基-1-丁醇(99%,Acros公司);豬胰脂肪酶(Fluka公司);冰乙酸、去離子水、乙酸乙烯酯、甲醇(AR)均購于成都科龍公司,使用前經(jīng)干燥與精餾處理。高效液相色譜(美國Waters公司),包括SymmetryShieldTMRP18色譜柱(5μm,3.9mm×150mm)、Waters515型高壓輸液泵;AllChromPlus工作站(美國MultiLink公司);Jasco2090Plus旋光檢測器(日本Jasco公司);流動相:甲醇∶去離子水=2∶1(V/V),流速:0.6mL/min;色譜柱以及旋光檢測器溫度均為30℃。SQ-206氣相色譜儀(北京分析儀器廠),包括PEG-20M柱、氫火焰離子檢測器;載氣:N2,流速:25mL/min;H2、空氣流速分別為36mL/min與360mL/min;汽化室、柱箱與檢測器溫度分別為:190℃、95℃、190℃。WZZ-2B自動旋光儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。3.2s-乙酸異戊酯分離純化一定量(S)-2-甲基-1-丁醇與冰乙酸在濃硫酸催化下反應(yīng)生成(S)-乙酸異戊酯,經(jīng)分離純化后,用氣相色譜檢測純度(須>98%,方可投入后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用)。3.3不同度對酯、醇、適合的降解(S)-2-甲基-1-丁醇與乙酸乙烯酯混合液(摩爾比=1∶1.3)中,加入一定量豬胰脂肪酶(酶:醇=1∶10,質(zhì)量比),在磁力攪拌器(260r/min)中反應(yīng),溫度分別控制在20℃、30℃、35℃、45℃、55℃。每隔2h抽樣,用氣相色譜檢測樣品中酯與醇的峰面積比K,并根據(jù)轉(zhuǎn)化率標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插得醇轉(zhuǎn)化率X,用HPLC-PD檢測產(chǎn)物(S)-乙酸異戊酯的旋光峰面積A,并根據(jù)式(4)計(jì)算其e.e.。(R,S)-2-甲基-1-丁醇酶促脂交換反應(yīng)同上,與乙酸乙烯酯混合液在磁力攪拌器中反應(yīng),利用HPLC-PD檢測產(chǎn)物e.e.,當(dāng)其達(dá)到最大值時(shí),停止反應(yīng)。精餾分離出(S)-乙酸異戊酯并用NaOH溶液水解,得終產(chǎn)品(S)-2-甲基-1-丁醇,用自動旋光儀測試其旋光度。4結(jié)果與討論4.1線性結(jié)果與標(biāo)樣的轉(zhuǎn)化率由檢測原理可知:反應(yīng)中C(醇)轉(zhuǎn)化率X的準(zhǔn)確性對于檢測方法可靠性至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)以氣相色譜檢測轉(zhuǎn)化率(也可用液相色譜)。以標(biāo)樣的轉(zhuǎn)化率X對氣相色譜檢測的峰面積比K(酯/醇)作圖(見圖1)。標(biāo)準(zhǔn)曲線表達(dá)式為:X=0.1951K6-0.9799K5+2.162K4-2.7737K3+1.9413K2-0.0151K,(0≤X≤0.6),R2=0.9997,則反應(yīng)過程中任意時(shí)刻樣品中醇轉(zhuǎn)化率X即可由氣相色譜分析結(jié)果計(jì)算出。4.2峰面積as檢測算法精密度和穩(wěn)定性是衡量檢測方法的重要指標(biāo)。(S)-乙酸異戊酯用HPLC-PD檢測其旋光峰面積AS,分別于同一天與連續(xù)6d內(nèi)進(jìn)行檢測(檢測條件保持一致),計(jì)算日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)差和日間相對標(biāo)準(zhǔn)差(進(jìn)樣量為5μL)。日內(nèi)RSD為0.44%(n=5),日間RSD=0.27%(n=6),該結(jié)果說明HPLC-PD精密度高,由儀器帶來的偶然誤差很小。4.3轉(zhuǎn)化率x0.6對b-5個(gè)時(shí)段的e.e.在(S)-2-甲基-1-丁醇的酯交換反應(yīng)過程中,(S)-醇乙酰化生成了(S)-乙酸異戊酯。理論上,反應(yīng)體系任意時(shí)刻抽取樣品中(S)-2-甲基-1-丁醇與(S)-乙酸異戊酯都有e.e.=100%。在5個(gè)不同溫度下,對抽取樣品進(jìn)行測定,(S)-2-甲基-1-丁醇的轉(zhuǎn)化率X以及(S)-乙酸異戊酯的e.e.,如表1所示。由表1中5個(gè)溫度段和5個(gè)時(shí)間段總共50組e.e.數(shù)據(jù)可以看出,當(dāng)轉(zhuǎn)化率X≤0.6時(shí),樣品中CB(乙酸異戊酯)97.3%≤e.e.≤103.8%,最大相對誤差REmax=3.8%,平均相對誤差REav=2.224%。由以上數(shù)據(jù)中可以看出,84%的e.e.(21組)都在97%與103%的范圍內(nèi),其相對誤差RE<3%。另外16%相對誤差較大的e.e.(4組)都是在X的最小值與最大值出現(xiàn)的。在檢測原理方程中,X與A都是與真實(shí)值存在一定誤差的測量值,而轉(zhuǎn)化率X是用氣相色譜(FID檢測器)檢測,FID檢測器的靈敏度與線形范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HPLC-PD,因而X的相對誤差要更小一些。由此推斷:當(dāng)X較小時(shí)(X<0.3),生成的(S)-乙酸異戊酯的量較小(體積百分含量X﹤16%),此時(shí)由HPLC-PD得出的A與真實(shí)值出現(xiàn)了偏差;而當(dāng)X較大(0.6～0.7)時(shí),此時(shí)A相對誤差較小,而X卻位于轉(zhuǎn)化率標(biāo)準(zhǔn)曲線的末端。用數(shù)學(xué)表達(dá)式計(jì)算出的X相對誤差增大,從而使e.e.相對誤差增加。由于HPLC采用手動進(jìn)樣,不能保證每次V1完全一致,也會引入一定誤差,因此,在峰形良好的情況下,采用大進(jìn)樣量(5μL),可以減小誤差。4.4s-2-甲基-1-丁醇及hplc-pd的比較(R,S)-2-甲基-1-丁醇與乙酸乙烯酯在PPL催化下發(fā)生酯交換反應(yīng),當(dāng)產(chǎn)物e.e.值達(dá)到最大時(shí),停止反應(yīng)。通過精餾分離出(S)-乙酸異戊酯,將其堿水解,得到的(S)-2-甲基-1-丁醇經(jīng)干燥、蒸餾后,測試旋光度(以99%(S)-2-甲基-1-丁醇作標(biāo)樣,αD=-4.515,t=30℃),并與HPLC-PD所得結(jié)果相比較,見表2所示。由此可知,用自動旋光儀檢測出旋光度并與標(biāo)準(zhǔn)品對照的常規(guī)檢測方法的結(jié)果,與采用HPLC-PD檢測新方法的e.e.結(jié)果比較,其最大相對誤差REmax=2.85%,說明了該方法是準(zhǔn)確并且可靠的。4.5試驗(yàn)方法的應(yīng)用和普4.5.1-pd實(shí)時(shí)定性分析在新手性物研發(fā)過程中,即使沒有單一對映體標(biāo)樣(即AS未知,僅能作為一個(gè)常量),仍可通過HPLC-PD實(shí)時(shí)定性分析求取反應(yīng)過程抽取樣品中對映體e.e.。由式(4)可知,當(dāng)AS未知,僅作為一個(gè)常量,反應(yīng)過程中任意時(shí)刻t2所抽取樣品中產(chǎn)品CB的e.e.相對大小仍能依據(jù)式(5)求出:固定t1(t2>t1),隨著反應(yīng)進(jìn)行,Δe.e.會出現(xiàn)一個(gè)極大值,可以確立反應(yīng)終點(diǎn)以及優(yōu)化反應(yīng)條件。4.5.2實(shí)時(shí)定量檢測樣品中對映射體e.e在新手性物研發(fā)過程中,可根據(jù)4.5.1所述,確定反