高效液相法測定一次性使用輸液器中鄰苯二甲酸二2-乙基己基酯溶出量

高效液相法測定一次性使用輸液器中鄰苯二甲酸二2-乙基己基酯溶出量

1.dehp與pvc輸注的安全性評價二聚苯二羧酸二醇（deph）是第一種一次性使用塑料薄膜劑（pvc）的提議，被廣泛使用。DEHP與PVC分子之間僅以范德華力和氫鍵相連,在臨床使用過程中,DEHP會從PVC輸液器中遷移出來,伴隨藥物輸注進入人體。近年相關研究表明,DEHP具有慢性毒性[10~11],人體內的長期累積會影響肌肉骨骼系統(tǒng)和中樞神經系統(tǒng)、肝臟組織,特別是男性生殖健康。因此,美國FDA在其發(fā)表的關于DEHP增塑PVC醫(yī)療器械安全性評價的研究報告中,提出要重視和監(jiān)控醫(yī)療器具中DEHP的釋放。鑒于此,本文建立了測定一次性PVC輸液器中DEHP溶出量的高效液相色譜法(HPLC)。2.材料和方法2.1超純水系統(tǒng)、旋轉蒸發(fā)儀、高壓液相色譜圖95%乙醇(成都科隆化學試劑公司,AR),甲醇(國藥化學試劑公司,色譜純),DEHP標準品(山東宏信化工股份有限公司,純度≥99.5%),純水/超純水系統(tǒng)(美國Pall,Cascada),旋轉蒸發(fā)儀(德國IKA,RV10),紫外/可見光分光光度計(美國Beckman,DU800),高壓液相色譜(美國Waters,e2695-2489),國產一次性使用輸液器(批號:2011051109)。2.2乙醇-超純水浸提液配制按照GB14232.1-2004中醇溶出物測定要求,用95%乙醇和超純水,通過液體比重天平測定并配制2000mL密度為(0.9373~0.9378)g/ml的乙醇水混合液作為浸提液。2.3色譜柱和流動相檢測器:紫外/可見光檢測器,檢測波長n=272nm;色譜柱:SunfireC18,5.0μm,4.6mm×150mm;柱溫:室溫;流動相:甲醇(色譜純);流量:1.0ml/min;進樣量:5μl。2.4方法學研究2.4.1標準溶液的配制精密稱取DEHP標準品2.0010g,用甲醇稀釋至100ml,得到濃度為20.01mg/ml的標準儲備液。取標準儲備液,用甲醇稀釋200倍,得到0.10mg/mL的標準工作溶液,用紫外/可見分光光度計在190nm~1100nm范圍內進行掃描,根據(jù)吸收光譜曲線確定HPLC檢測波長(n)。2.4.2dehs保留時間的確定取DEHP標準儲備液,用甲醇稀釋得到一定濃度的標準工作溶液,在2.3色譜條件下進樣測量,得到DEHP的出峰保留時間。2.4.3標準曲線及進樣測定取DEHP標準儲備液用甲醇逐級稀釋,得到2001ug/ml~5ug/ml濃度的標準溶液,按照2.3中色譜條件進樣測定,得到各濃度的峰面積值。以峰面積值(Y)為縱坐標,DEHP濃度(X)為橫坐標,繪制DEHP標準曲線并得到線性回歸方程。2.4.4定量檢測限的確定取DEHP標準儲備液用甲醇逐級稀釋,得到一系列濃度的標準工作溶液,按照2.3色譜條件進樣測定,將信噪比≥100的最小DEHP濃度定為定量檢測限。2.4.5標準工作溶液的測量取DEHP標準儲備液用甲醇逐級稀釋,得到濃度為1500μg/ml~5μg/ml的標準工作溶液,按照2.3色譜條件進樣測定,每種濃度樣品連續(xù)進樣測定5次,得到其峰面積,計算變異系數(shù)(RSD),進行測量值的精確度表征,考察結果重復性。2.4.6加標回收率和變異系數(shù)試驗準確吸取3份浸提液各1ml,與濃度分別為2000ug/ml、1000ug/ml、500ug/ml各1mlDEHP標準工作液均勻混合,得到高、中、低三種濃度的加標回收樣品溶液,用旋轉蒸發(fā)儀蒸干,冷卻至室溫,殘余物用4mL甲醇渦旋溶解后得到樣品檢驗液,靜置數(shù)分鐘后吸取上清,按2.3色譜條件對每個加標回收樣品檢驗液測定3次,計算回收率(%)和變異系數(shù)(RSD)。2.5供試液及輸注液制備將配制好的乙醇水浸提液用膠塞玻璃瓶分裝(500ml/瓶,共4瓶,),懸掛于輸液架上,取出輸液器樣品,模擬臨床操作和條件,調節(jié)流速在2.5~3.0ml/min范圍內(流速上限),收集全部流出液作為供試液1;重復上述操作,調節(jié)流速在0.5~1.0ml/min范圍內(流速下限),依次對每瓶浸提液進行輸注,收集全部流出液作為供試液2。將上述供試液分別用旋轉蒸發(fā)儀蒸干,冷卻至室溫,殘余物用4mL甲醇渦旋溶解后得到樣品檢驗液,靜置數(shù)分鐘后吸取上清,按2.3色譜條件進樣測定得到峰面積值,將其代入相應線性回歸方程即得DEHP濃度(C,ug/ml),按下式換算每套輸液器的DEHP溶出量(M,mg/套):3.結果與討論3.1苯環(huán)吸收光譜剖面如圖1所示,DEHP在190nm處有飽和鍵(C-C)吸收峰、202~238nm處有不飽和鍵(C=C、C=O)和雜原子飽和鍵(C-O-C)的吸收峰,在272nm處有苯環(huán)特征吸收峰。因此,以272nm作為HPLC的檢測波長。3.2deph峰維護時間見圖2。3.3dehp與其他藥物的接觸已有不少研究[2~3,5~8]對供試液的制備采用的是截取產品某一部分,對其進行浸泡和萃取的方式。這種方法在產品的質量控制評價方面是可行的[5~8],但通過這種方法測得的DEHP溶出量卻難以反映產品臨床實際使用時的風險[2~3],因為產品使用時與浸提液的接觸是動態(tài)過程,而浸泡方法是靜態(tài)過程,這兩種浸提過程對DEHP的浸提能力會有較大區(qū)別。另外,產品使用時與浸提液的接觸是整個內腔而不是局部,所以局部浸提的結果不能反映產品使用的真實情況。因此本研究采用模擬臨床使用條件的供試液制備方法。再者,輸液藥物分為晶體液類(生理鹽水、葡萄糖等)和脂類藥物。已有安全性評價結果顯示,DEHP在與晶體液接觸時溶出極少,其進入人體的含量對人體幾乎沒有危害。而DEHP與脂類藥物接觸時卻容易溶出。所以我們只針對一次性使用輸液器輸注脂類藥物時DEHP溶出量進行研究。乙醇水溶液是脂類溶劑,可替代脂類藥物作為本研究的溶出檢測液。同時針對一次性使用輸液器的使用要求,流速一般為0.5ml/min~3ml/min,本研究分別選擇了0.5~1.0ml/min和2.5~3.0ml/min兩種流速,全面考察此產品的DEHP溶出量。3.4標準曲線和線性回歸方程由圖3可知,線性回歸方程1:Y=828.32X+22000,相關系數(shù)r=0.9986,結果顯示DEHP濃度在2001ug/ml~5ug/ml范圍內與其峰面積值線性關系良好。由于2001ug/ml~5ug/ml的線性相關范圍較寬,在確定一次性輸液器中DEHP溶出量時會存在較大誤差,因此把整個濃度范圍劃分為高、低2個濃度等級,即2001ug/ml~100ug/ml和250ug/ml~5ug/ml,分別在各自范圍內得到標準曲線和線性回歸方程,如下:圖4、圖5顯示,線性回歸方程2:Y=804.71X+53814,相關系數(shù)r=0.9982;線性回歸方程3:Y=924.42X+5588.6,相關系數(shù)r=0.9991。結果顯示DEHP濃度在2001ug/ml~100ug/ml和250ug/ml~5ug/ml范圍內與其峰面積值線性關系良好。3.5方法精神由表2可知,本方法的DEHP定量檢測限為0.5ug/ml。3.6方法的精度見表3,RSD均<5%,表明此方法在較寬的線性范圍內具有良好的精密度。3.7回收率的確定加標回收率測定考察的是供試液制備和處理以及儀器測試過程中待測目標物的前處理情況,以此來衡量測試方法的可行性?；厥章室话阍?0%~110%之間比較合適。結果見表4,本方法回收率均在98%~103%之間,RSD均<5%,說明采用的測量方法準確度高,精確度好。3.8局限性的溶出量見圖6、圖7,由樣品檢驗液1和2的DEHP色譜圖及其峰面積,對比DEHP標準曲線,認為較適用的是2001ug/ml~100ug/ml范圍內的線性回歸方程2,據(jù)此計算出樣品檢驗液1和2中的DEHP濃度(n=3),見表5。以2.5~3.0ml/min的流速用此一次性使用輸液器進行輸注,在本試驗條件下每套產品DEHP溶出量(mg)為:524.52×4/1000=2.10以0.5~1.0ml/min的流速用此一次性使用輸液器進行輸注,在本試驗條件下每套產品DEHP溶出量(mg)為:813.89×4/1000=3.26DEHP的溶出量與浸提液的接觸時間成正比。2.10mg的溶出量是在臨床輸注流速上限的情況下測得,浸提液與輸液器的接觸時間較短,可視為最小溶出量;而3.26g的溶出量是在臨床輸注流速下限的情況,浸提液與輸液器的接觸時間較長,屬于極限浸提,可視為最大溶出量。所以,此一次性使用輸液器在臨床使用輸注脂類藥物時的DEHP溶出量應在2.10mg~3.26mg之間。這個數(shù)值范圍可作為本類產品DEHP風險分析的參考數(shù)據(jù)。4.dehp濃度范圍的確定在我國的醫(yī)療器械分類監(jiān)管中,其相關的國家和行業(yè)標準中并沒有針對臨床實際使用條件下PVC醫(yī)療器械產品中的DEHP溶出指標的限量要求和統(tǒng)一方法。因此,為更好地保護患者的身體健康,應盡可能地在相關產品標準上體現(xiàn)這一點