nep1-40基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷大鼠行為學(xué)恢復(fù)的影響

nep1-40基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷大鼠行為學(xué)恢復(fù)的影響

神經(jīng)干預(yù)（iuc）移植是對(duì)脊柱損傷最具前景的研究方向，但單純移植后細(xì)胞存活率低，以及局部微環(huán)境中nogo蛋白等因素的存在嚴(yán)重限制了新軸突生長(zhǎng)。NEP1-40多肽作為Nogo蛋白的拮抗劑能間接促進(jìn)新生軸突的生長(zhǎng),已成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn),但是單獨(dú)運(yùn)用也存在諸多不足。由此,本研究從基因工程角度出發(fā),在體外制備NEP1-40基因修飾的NSC并移植到大鼠脊髓損傷區(qū),觀察細(xì)胞移植后大鼠行為學(xué)功能的恢復(fù)情況,以期為NSC移植治療脊髓損傷提供一種新的思路。1材料和方法1.1動(dòng)物和主要試劑、儀器1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及設(shè)備清潔級(jí)孕18dSprague-Dawley(SD)大鼠1只及成年雌性SD大鼠40只,體質(zhì)量245~268g,平均250g,由四川大學(xué)華西動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物許可證號(hào):No.scxk[chuan]2004-14)。本實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的所有處理均符合科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》之規(guī)定。1.1.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法胎牛血清(上海微科生化試劑公司);重組人表皮生長(zhǎng)因子(hEGF)、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝素、神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(NeuroCult®NS-ABasalMedium)、神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基(NeuroCult®NS-AProliferationSupplements)、神經(jīng)小球分散試劑盒(NeuroCult®ChemicalDissociationKitProductDescription)(美國(guó)StemCell公司);兔多克隆抗體巢蛋白(Nestin)(美國(guó)Proteintechgroup公司),IGO750細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)ThermoElectronCorporation公司);GX51倒置相差顯微鏡、BX51TF熒光顯微鏡(日本Olympus公司),5μL微型注射器(北京英偉達(dá)科技公司)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1慢病毒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的構(gòu)建本研究中我們采用在前期研究中已成功構(gòu)建的NEP1-40基因慢病毒表達(dá)載體。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物經(jīng)電泳分析表明成功獲取NEP1-40基因cDNA克隆,測(cè)序提示慢病毒轉(zhuǎn)染質(zhì)粒連接構(gòu)建正確;蛋白質(zhì)印跡法顯示NEP1-40在293T細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染脫頸法處死孕18dSD大鼠后,取出子宮置于預(yù)冷的0.1%磷酸鹽緩沖液浸泡5min,取出胎鼠并在顯微鏡下分離出兩側(cè)大腦皮層,轉(zhuǎn)移至含預(yù)冷NSC完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)制成細(xì)胞懸液后用200目濾網(wǎng)過濾,靜置5min后棄上清液,細(xì)胞重懸于NSC完全培養(yǎng)液(基礎(chǔ)培養(yǎng)基與擴(kuò)增添加物混合比例為9︰1),培養(yǎng)基中加入hEGF(20ng/mL)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(10ng/mL)、肝素(2μg/mL)、鏈霉素(100μg/mL)及青霉素(100μg/mL),活細(xì)胞計(jì)數(shù)后按1×106/L的密度接種于75cm2培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng),每3天半量換液。細(xì)胞傳代后取第3代細(xì)胞進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染:800r/min離心5min(離心半徑15cm)后棄上清液收集神經(jīng)球,加入神經(jīng)小球分散劑獲取NSC單細(xì)胞懸液,按每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi),于37℃、5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng),轉(zhuǎn)染時(shí)先按感染復(fù)數(shù)值=10計(jì)算所需加入病毒載體的體積,用計(jì)算出的NEP1-40慢病毒載體轉(zhuǎn)染密度為1×107的NSC,輕輕混勻,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng),24h后重復(fù)感染1次。48h后觀察熒光表達(dá)情況,同時(shí)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。1.2.3手術(shù)方法及分組40只雌性SD大鼠經(jīng)切除第8~10胸椎椎板顯露硬脊膜:10只在切除椎板后用生理鹽水沖洗創(chuàng)面并關(guān)閉切口,即假手術(shù)組,余30只在第9胸椎水平進(jìn)行脊髓右側(cè)半切后間斷縫合硬膜并關(guān)閉切口。術(shù)畢放置在40℃恒溫加熱墊上直至完全蘇醒后放回原籠。30只脊髓半切大鼠在手術(shù)7d后隨機(jī)分為3組,每組各10只:脊髓損傷組、神經(jīng)干細(xì)胞移植組(NSC組)和NEP1-40基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植組(NEP1-40-NSC組)。沿原切口顯露受損脊髓節(jié)段后采用局部多點(diǎn)注射法,在3組大鼠脊髓損傷部位用微量注射器分別植入5μL細(xì)胞培養(yǎng)液、NSC懸液及NEP1-40-NSC懸液(濃度約為1×105個(gè)細(xì)胞/μL),注射位置在距離損傷處頭尾側(cè)各約2mm處,注射速度為0.5μL/min,注射完畢后留針10min,縫合硬脊髓和手術(shù)切口。1.3行為測(cè)試指標(biāo)1.3.1運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)又稱為開放領(lǐng)域運(yùn)動(dòng)測(cè)試,是將大鼠置于一個(gè)大小約150cm×60cm的平坦橢圓形運(yùn)動(dòng)區(qū)域,觀察大鼠的運(yùn)動(dòng)情況4min,根據(jù)BBB測(cè)試評(píng)分表對(duì)受檢大鼠右后肢的運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分,評(píng)分范圍為0分(后肢全癱)至21分(后肢完全正常運(yùn)動(dòng))。1.3.2自由行駛的準(zhǔn)將大鼠置于一個(gè)100cm×38cm的懸空網(wǎng)格狀區(qū)域(網(wǎng)格開口標(biāo)準(zhǔn)為2cm×2cm),讓其自由爬行。為了量化方便,由專人記錄大鼠在通過網(wǎng)格時(shí)右后肢摔倒(即肢體無法抓住網(wǎng)格而落入網(wǎng)孔中)的次數(shù)并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià),每只大鼠連續(xù)測(cè)試3次取平均值作為最終測(cè)試結(jié)果。1.4數(shù)據(jù)處理及分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn);檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果2.1分離和誘導(dǎo):新冠肺炎細(xì)胞中nip1-40基因的轉(zhuǎn)染分離接種的細(xì)胞從圓形單細(xì)胞逐漸增多匯聚形成大小不一、折光性較好的神經(jīng)細(xì)胞球(圖1)。傳代培養(yǎng)生成的第3代神經(jīng)球通過Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色后在熒光顯微鏡下可見神經(jīng)球Nestin染色呈陽性表達(dá)(圖2)。轉(zhuǎn)染完成后在熒光顯微鏡下觀察證實(shí)NEP1-40已進(jìn)入NSC內(nèi),48h時(shí)NEP1-40基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)可見綠色熒光,說明轉(zhuǎn)染成功(圖3)。且上述轉(zhuǎn)染后的NSC經(jīng)分化培養(yǎng)后可見NEP1-40慢病毒基因組及空病毒載體組分化后的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞中均可見綠色熒光,說明分化后NEP1-40基因可在子代細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明經(jīng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中NEP1-40基因表達(dá)明顯上調(diào),且與其他對(duì)照組有明顯差異(P<0.05),用NEP1-40F和綠色熒光蛋白受體引物,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度220bp。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染后的表達(dá)產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量為32×103,與融合基因的產(chǎn)物NEP1-40與綠色熒光蛋白(GFP)融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量相吻合,證明NEP1-40基因成功轉(zhuǎn)入NSC內(nèi)(圖4)。2.2動(dòng)物術(shù)后右術(shù)后撤銷術(shù)中3只大鼠誤傷及左側(cè)半脊髓,2只因麻醉過深導(dǎo)致死亡,術(shù)后24h內(nèi)1只出現(xiàn)嚴(yán)重腹脹而死亡,以上5只均被排除并及時(shí)補(bǔ)足。余動(dòng)物術(shù)后約30min恢復(fù)清醒,3h開始進(jìn)飲食,大小便正常。除假手術(shù)組外,其余動(dòng)物術(shù)后均出現(xiàn)右后肢癱瘓(圖5)。術(shù)后第7天細(xì)胞移植操作順利,術(shù)后所有動(dòng)物均恢復(fù)清醒和活動(dòng),未見明顯不良反應(yīng),移植術(shù)中及術(shù)后均無死亡。2.3行為測(cè)試2.3.1小鼠骨髓損傷后右下肢功能的恢復(fù)脊髓半切術(shù)后1周時(shí),所有大鼠右后肢仍處于癱瘓狀態(tài),僅少數(shù)表現(xiàn)出輕微的恢復(fù)(表明嚙齒類動(dòng)物脊髓損傷后有一定的自我修復(fù)能力)。至細(xì)胞移植后8周時(shí),脊髓損傷組大鼠右后肢功能僅有輕度恢復(fù),肢體內(nèi)旋狀且無法支持體重;NSC組右后肢情況有所改善,呈外旋狀但仍然無法支持體重;NEP1-40-NSC組的大鼠則有明顯恢復(fù),在行走時(shí)右后肢外旋并能部分負(fù)重。假手術(shù)組大鼠右后肢功能未見任何異常。2.3.2假手術(shù)組與假手術(shù)組左術(shù)后運(yùn)動(dòng)完全正常,bcb評(píng)分比較所有脊髓半切大鼠術(shù)后即刻BBB評(píng)分為0分。術(shù)后1周時(shí)(細(xì)胞移植之前),右后肢均無法完成負(fù)重行走,呈拖行狀態(tài),評(píng)分為(0.70±0.65)分,明顯低于假手術(shù)組(右后肢運(yùn)動(dòng)完全正常,BBB評(píng)分均為21分),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。細(xì)胞移植后8周時(shí),脊髓損傷組、NSC組和NEP1-40-NSC組大鼠評(píng)分分別為(3.20±0.65)、(8.70±0.95)和(12.00±1.56)分,3組之間兩兩比較結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且均明顯低于假手術(shù)組(右后肢運(yùn)動(dòng)完全正常,BBB評(píng)分均為21分),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。2.3.3術(shù)后組和假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)倒情況所有脊髓半切大鼠術(shù)后即刻網(wǎng)格測(cè)試中摔倒次數(shù)為(17.20±0.85)次。術(shù)后1周時(shí)(細(xì)胞移植之前)的網(wǎng)格測(cè)試中,右后肢仍呈拖行狀態(tài),完全無法負(fù)重,經(jīng)常摔入網(wǎng)格孔中,摔倒次數(shù)為(15.50±1.96)次,明顯高于假手術(shù)組(右后肢均未見摔倒,評(píng)分均為0分)(P<0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。細(xì)胞移植后8周時(shí),脊髓損傷組、NSC組和NEP1-40-NSC組大鼠的摔倒次數(shù)則分別為(13.30±1.77)、(7.90±0.99)和(4.5±0.85)次,3組之間兩兩比較結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且均明顯高于假手術(shù)組(右后肢均未見摔倒,評(píng)分均為0分),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。3nogo-66與nop1-40研究發(fā)現(xiàn)單純NSC移植后新生神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)受到明顯抑制,這種抑制作用主要有2個(gè)來源:一是星形膠質(zhì)細(xì)胞增生形成的膠質(zhì)瘢痕;二是來源于中樞神經(jīng)髓鞘的髓磷脂相關(guān)抑制物,其中Nogo蛋白的抑制作用最強(qiáng),且相關(guān)研究報(bào)道也最多。自2000年Chen等報(bào)道克隆出Nogo基因序列以來,深入研究發(fā)現(xiàn)Nogo基因共有3個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄本,其所編碼蛋白質(zhì)分別為Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C,其中Nogo-A相對(duì)分子質(zhì)量最大且發(fā)揮主要作用。這3種蛋白質(zhì)在其碳末端上2個(gè)疏水性基團(tuán)間均存在1個(gè)由66個(gè)氨基酸殘基組成的襻狀結(jié)構(gòu)狀結(jié)構(gòu),稱作Nogo-66。Nogo蛋白抑制軸突生長(zhǎng)的機(jī)制主要是由Nogo-66與其下游受體分子信號(hào)復(fù)合物NgR/P75NTR/Lingo-1(或gR/Troy/Lingo-1)結(jié)合,啟動(dòng)了Rho信號(hào)傳導(dǎo)途徑。以Nogo-A為靶點(diǎn)通過使用Nogo抗體和Nogo基因敲除等手段,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察到中樞神經(jīng)纖維得到良好再生。2007年Su等研究顯示Nogo-A加強(qiáng)了移植的嗅鞘細(xì)胞在病灶處的相互黏附,阻礙了細(xì)胞遷移,從而影響了治療效果。2010年Hou等發(fā)現(xiàn)Nogo-A在增殖中的NSC上表達(dá)較強(qiáng),它除了抑制軸突的出芽式生長(zhǎng)外,還能阻礙NSC向神經(jīng)元分化。由此看來,Nogo基因及相關(guān)蛋白在軸突再生抑制過程中發(fā)揮了極其重要的作用。2002年GrandPré等首次提出Nogo受體拮抗劑的概念,NEP1-40是針對(duì)Nogo-66的氨基序列設(shè)計(jì)的,其結(jié)構(gòu)與Nogo-66氨基端40個(gè)氨基酸殘基結(jié)構(gòu)相同,它可與NgR相結(jié)合而不激活信號(hào)傳導(dǎo)通路,因此可競(jìng)爭(zhēng)性抑制Nogo-66與NgR的結(jié)合,從而阻斷Nogo-66的抑制效應(yīng),NEP1-40逐漸成為促軸突再生研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)之一。有學(xué)者已應(yīng)用脊髓損傷和腦損傷動(dòng)物模型證明NEP1-40能夠顯著促進(jìn)皮質(zhì)脊髓束的再生。Li等將合成的NEP1-40多肽定位注射大鼠脊髓半橫斷損傷模型,可明顯促進(jìn)損傷軸突的生長(zhǎng)及大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。由此看來NEP1-40作為NgR拮抗劑有望成為脊髓損傷等軸突再生障礙疾病新的治療手段。然而,目前研究中所使用的NEP1-40都是經(jīng)人工化學(xué)合成,其成本較高,很多學(xué)者通過腹腔注射、損傷局部注射等手段將NEP1-40多肽帶到中樞神經(jīng)損傷處來促進(jìn)軸突的再生,但由于血腦屏障和血脊膜屏障的存在,大于6個(gè)氨基酸的多肽一般不易穿過這些屏障,而損傷局部注射法雖然能使NEP1-40直達(dá)病灶但是僅有少量多肽能保留活性并最終發(fā)揮作用。這些問題都使得NEP1-40多肽的進(jìn)一步應(yīng)用受到了極大的限制?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展較好的克服了單純NSC移植和NEP1-40多肽應(yīng)用的局限性。目前已可通過多種手段來獲取NEP1-40基因,使其在病灶處完成NEP1-40蛋白的表達(dá),現(xiàn)已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中用于脊髓損傷等疾患的治療,國(guó)內(nèi)學(xué)者宮福良等通過基因工程手段從大鼠脊髓中獲取Nogo-66、NEP1-40基因并實(shí)現(xiàn)其蛋白的體外表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過基因釣取方法成功的從基因文庫中獲取NEP1-40基因,然后構(gòu)建攜帶該基因的慢病毒載體,通過病毒轉(zhuǎn)染的方法成功將NEP1-40基因?qū)隢SC的基因組中,通過脊髓損傷局部的細(xì)胞移植進(jìn)入到宿主的病灶處,并在宿主體內(nèi)表達(dá)NEP1-40而發(fā)揮作用,從而克服了上述局限性。1995年美國(guó)Ohio大學(xué)研究人員提出了BBB評(píng)分法。將大鼠后肢運(yùn)動(dòng)分為22個(gè)等級(jí),后肢全癱為0分,完全正常為21分,評(píng)估觀察時(shí)間為4min。BBB評(píng)分表是根據(jù)觀察脊髓損傷大鼠經(jīng)過3個(gè)階段的恢復(fù)而建立的,其與行為學(xué)恢復(fù)進(jìn)展是同步的。分值中第1部分:0~7分,評(píng)估恢復(fù)早期的后肢關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng);第2部分:8~13分,評(píng)估恢復(fù)中期的步態(tài)和協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng);第3部分:14~21分評(píng)估運(yùn)動(dòng)時(shí)爪子的精細(xì)運(yùn)動(dòng)。該方法的優(yōu)勢(shì)在于操作簡(jiǎn)便、可重復(fù)性好,其缺點(diǎn)在于評(píng)分過程中人為主觀因素對(duì)分值的影響很大。此外BBB評(píng)分系統(tǒng)并不是一個(gè)線性系統(tǒng),量表中每一個(gè)評(píng)分區(qū)域?qū)υu(píng)估對(duì)象均有一定的側(cè)重,這樣在評(píng)分過程中難免產(chǎn)生一定差距,尤其是14分以上是對(duì)于運(yùn)動(dòng)細(xì)節(jié)的評(píng)估。在本研究中,除了假手術(shù)組大鼠外,其余動(dòng)物的評(píng)分均在14分以下,意味著所有脊髓半切的大鼠的精細(xì)運(yùn)動(dòng)均無明顯恢復(fù),這樣就減少了BBB評(píng)分系統(tǒng)的缺陷給本研究結(jié)果帶來的偏差,增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的客觀性。脊髓損傷后脊髓下行信號(hào)通路的運(yùn)動(dòng)控制功能出現(xiàn)故障,由皮質(zhì)脊髓束所介導(dǎo)的前后肢協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)和步行節(jié)律被破壞,那么