異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷大鼠的臨床研究

異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷大鼠的臨床研究

不同的生長(zhǎng)條件下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（msc）可分為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞，也可分為神經(jīng)和神經(jīng)膠體細(xì)胞。因此,MSCs用于修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷成為又一熱點(diǎn)。異體MSCs是否引發(fā)排斥反應(yīng),是人們關(guān)心的問(wèn)題。最近發(fā)現(xiàn)MSCs具有抑制免疫反應(yīng)作用,并有在體外行MSCs對(duì)T細(xì)胞亞群影響的研究,但在體內(nèi)對(duì)T細(xì)胞亞群影響的報(bào)道較少。我們采用經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔注射異體MSCs,治療大鼠脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI),重點(diǎn)研究該方法對(duì)T細(xì)胞亞群的影響。1材料和方法1.1單克隆抗體低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司,美國(guó)),小鼠抗大鼠CD4單克隆抗體、CD8單克隆抗體(Serotec公司,英國(guó))。Eliteesp型流式細(xì)胞儀(Beckman公司,美國(guó)),MCO-15AC型CO2孵箱(Sanyo公司,日本),TDL-5-A型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),IX50型倒置相差顯微鏡(Olympus公司,日本)。1.2細(xì)胞傳代及分離采用密度梯度離心法進(jìn)行細(xì)胞分離及培養(yǎng)。取6周齡SD大鼠10只,體重100～150g,雌雄不限(四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。斷頸處死后,無(wú)菌條件下取出股骨及脛骨,暴露骨髓腔。7號(hào)針穿刺骨髓腔,用含肝素的DMEM液沖洗骨髓至無(wú)菌平皿中。將細(xì)胞懸液移入離心管,以離心半徑22cm,1200r/min離心10min;吸去含有脂肪及血小板的上清液,按2∶1比例加入比重為1.077的淋巴細(xì)胞分離液,以離心半徑22cm,3000r/min離心30min。離心后管內(nèi)容物分為三層,在上、中層液體界面處可見(jiàn)乳白色混濁的單核細(xì)胞層,吸取該層細(xì)胞,移入另一試管中,用L-DMEM稀釋,以離心半徑22cm,1200r/min離心10min。棄上清,加入含10%胎牛血清的L-DMEM,計(jì)數(shù)后按2.5×105個(gè)/cm2接種。37℃、5%CO2及飽和濕度下孵箱培養(yǎng),每3天換液。細(xì)胞融合80%～90%后傳代,傳代時(shí)采用0.25%胰酶(含0.1%乙二胺四乙酸)消化30s。傳至第6代后收集細(xì)胞,備用。1.3術(shù)后處理及術(shù)后防感染方案按文獻(xiàn)方法建立SCI動(dòng)物模型。雌性8周齡SD大鼠60只,體重220～250g(四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。動(dòng)物麻醉后,備皮消毒、俯臥位固定,以T11為中心,于背部取正中切口,顯露約3mm×4mm的脊髓打擊區(qū),將自制Allen打擊架的打擊導(dǎo)管緊貼硬膜,垂直對(duì)準(zhǔn)打擊中心,以50g·cm致傷力損傷脊髓。打擊時(shí)見(jiàn)大鼠雙后肢抽動(dòng)、甩尾,隨后完全松弛,明膠海綿覆蓋硬膜,逐層縫合切口。術(shù)中注意應(yīng)用腎上腺素及慶大霉素鹽水清洗傷口以止血、預(yù)防感染。術(shù)前及術(shù)后3d肌注抗生素,人工定時(shí)擠尿。術(shù)后7d,大鼠因尿道出血、自殘死亡8只。采用BBB后肢功能評(píng)分,得分為0者46只,占總數(shù)76.7%。隨機(jī)抽取4只經(jīng)體感誘發(fā)電位、脊髓病理組織切片證實(shí)為完全截癱。1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞的制備從BBB后肢功能評(píng)分為0的動(dòng)物中隨機(jī)取40只,分為實(shí)驗(yàn)組(A組)及對(duì)照組(B組),每組20只。另取20只體重220～250g的正常雌性8周齡SD大鼠(四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),作為空白組(C組)。A組:動(dòng)物麻醉后,后頸部備皮消毒,在枕外隆凸至上頸椎棘突做正中切口,逐層分離至環(huán)枕后膜,將預(yù)彎的微量注射器針尖以30°角輕刺入環(huán)枕后膜約1.5mm,進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔,緩慢注入經(jīng)BrdU(3μg/ml)標(biāo)記,細(xì)胞濃度為2×106/ml的MSCs細(xì)胞懸液1ml,注畢用明膠海綿填壓,以防細(xì)胞懸液外漏,逐層縫合切口。B組:以同樣方法經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔注入等量的L-DMEM。C組:不行任何處理。1.5小鼠血流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs注入后第1、2和3周,觀察各組大鼠一般情況及行BBB后肢功能評(píng)分;并經(jīng)心臟取血1ml,肝素抗凝,行流式細(xì)胞儀檢測(cè),所用抗體為FITC標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD4單克隆抗體,RPE標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD8單克隆抗體。第3周時(shí),A、B組大鼠經(jīng)4%多聚甲醛灌注固定,取損傷處脊髓,行組織切片觀察。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用q檢驗(yàn),P值<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1組患者治療前后bbbbbbb/3周bs評(píng)分比較A組死亡4只,B組死亡3只,C組無(wú)死亡。各組隨機(jī)取15只納入實(shí)驗(yàn),于第1、2及3周各取5只檢測(cè)。A組第3周BBB后肢功能評(píng)分優(yōu)于B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);A、B組在各時(shí)間點(diǎn)均低于C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。2.2cd4+/cd8+t細(xì)胞比例ld5A組CD4+T細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)均較B、C組少,CD8+T細(xì)胞第2、3周較B、C組少,CD4+/CD8+T細(xì)胞比值第1周較B、C組少,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但CD4+/CD8+T細(xì)胞比值第2、3周與B、C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。A組CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞第2周均比第1周減少,但CD4+/CD8+T細(xì)胞比值較第1周增加,第3周僅CD8+T細(xì)胞較第1周增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);B組CD8+T細(xì)胞第2、3周均較第1周多,CD4+/CD8+T細(xì)胞比值第2、3周均較第1周少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2、圖1。2.3社會(huì)學(xué)觀察A組第3周脊髓損傷處空泡縮小,有組織長(zhǎng)入,較B組有輕微改善,但未明確見(jiàn)到BrdU陽(yáng)性標(biāo)記的MSCs,見(jiàn)圖2。3mscs的免疫抑制作用MSCs用于SCI的治療,是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一。將MSCs直接注射到SCI部位效率較高,但存在二次損傷、破壞脊髓內(nèi)傳導(dǎo)束、增加脊髓感染幾率等缺點(diǎn),如有多個(gè)病灶,直接注射難以實(shí)現(xiàn)。經(jīng)靜脈移植,可避免上述缺點(diǎn),且在損傷處趨化因子的作用下,MSCs可以透過(guò)血-脊髓屏障遷移至病灶,有利于SCI的恢復(fù)。我們?cè)捎媒?jīng)尾靜脈移植異體MSCs治療大鼠SCI,提示MSCs可遷移到脊髓損傷處,且可表達(dá)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)志物——神經(jīng)元特異核蛋白、膠質(zhì)纖維酸性蛋白;同時(shí)也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遷移率不高,3周時(shí)約占移植細(xì)胞的4.4%。與靜脈移植相比,經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植具有類似優(yōu)點(diǎn),其內(nèi)的腦脊液經(jīng)過(guò)SCI表面,腦脊液比血液體積小,有望減少細(xì)胞用量,提高遷移效率。Ohta等發(fā)現(xiàn),采用蛛網(wǎng)膜下腔移植轉(zhuǎn)基因綠色熒光蛋白標(biāo)記的異體MSCs,3周時(shí),可經(jīng)損傷的軟脊膜到達(dá)SCI表面(少數(shù)可達(dá)其內(nèi)部);Satake等也證實(shí)可達(dá)損傷脊髓內(nèi)部,并分化為神經(jīng)元巢蛋白陽(yáng)性細(xì)胞。然而我們的結(jié)果卻表明,SCI表面未見(jiàn)MSCs,這可能與SCI模型制備時(shí)打擊能量未達(dá)100g·cm以上、軟脊膜損傷不夠大、細(xì)胞難以通過(guò)有關(guān);或與BrdU標(biāo)記方法不如轉(zhuǎn)基因綠色熒光蛋白標(biāo)記敏感有關(guān);也可能與移植細(xì)胞數(shù)量較少、傳代過(guò)多有關(guān),需進(jìn)一步深入探討。A組動(dòng)物脊髓組織切片、BBB后肢功能評(píng)分的改善,可能得益于MSCs分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的局部作用。體外實(shí)驗(yàn)亦表明MSCs可以產(chǎn)生多種有利于神經(jīng)修復(fù)的細(xì)胞因子。采用異體MSCs治療,是否引發(fā)排斥反應(yīng),是另一關(guān)心的問(wèn)題。中樞神經(jīng)系統(tǒng)通常被認(rèn)為是“免疫豁免區(qū)”,但近年研究表明,在一定程度上中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)異體組織也可發(fā)生免疫反應(yīng)。新近發(fā)現(xiàn)MSCs有免疫抑制作用,成為研究的又一熱點(diǎn)。在體外實(shí)驗(yàn),如混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng),不論MSCs分化與否均證實(shí)其有免疫抑制作用,但目前MSCs在體內(nèi)影響免疫系統(tǒng)的研究尚少見(jiàn)。LeBlanc等通過(guò)靜脈移植異體MSCs成功救治1例嚴(yán)重急性移植物抗宿主病Ⅳ期患者,而其余未采取相同措施的24例患者2個(gè)月內(nèi)全部死亡,提示MSCs有較好的免疫抑制作用。成熟的T淋巴細(xì)胞表面均可表達(dá)CD3,而CD4及CD8不能同時(shí)表達(dá)在細(xì)胞表面,故可將成熟的T淋巴細(xì)胞分為CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞兩個(gè)亞群。血液中T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)是觀察機(jī)體細(xì)胞免疫水平簡(jiǎn)便易行的重要方法。CD4+T細(xì)胞主要識(shí)別主要組織相容性復(fù)合物(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)Ⅱ類分子和抗原提呈細(xì)胞提呈的外源性抗原,主要表現(xiàn)為輔助和誘導(dǎo)功能(也有一些具有殺傷或抑制功能);CD8+T細(xì)胞主要識(shí)別MHCⅠ類分子和抗原提呈細(xì)胞提呈的內(nèi)源性抗原,主要表現(xiàn)為殺傷功能。T細(xì)胞在急性移植物抗宿主病中起主要作用,CD4+T細(xì)胞是關(guān)鍵,CD8+T細(xì)胞起促進(jìn)作用。CD4分子對(duì)維持免疫系統(tǒng)的功能有重要作用,希望通過(guò)干擾CD4+T細(xì)胞,進(jìn)而破壞細(xì)胞免疫功能,達(dá)到抗排斥的目的。人外周血中CD4+T細(xì)胞較CD8+T細(xì)胞多,CD4+/CD8+T細(xì)胞的比值為1.4～2.0。若比值偏低,說(shuō)明免疫排斥反應(yīng)較弱,反之,則較強(qiáng)。目前尚未見(jiàn)大鼠正常值,但可參考人類數(shù)值推測(cè)其免疫排斥變化規(guī)律。結(jié)合我們的研究,A組經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔注入異體MSCs后,第1周CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+T細(xì)胞比值均低于C組,表明機(jī)體處于一定免疫抑制狀態(tài);第2、3周,CD4+/CD8+T細(xì)胞比值變化不大,但CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞數(shù)量低于B、C組,表明機(jī)體仍處于輕度免疫抑制狀態(tài),在此期間內(nèi)經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔接受異體MSCs不會(huì)出現(xiàn)免疫排斥。分析其原因,可能與以下因素有關(guān):①與MSCs表面缺乏(或極低量的表達(dá))MHCⅡ類抗原的表達(dá)有關(guān);也不表達(dá)共刺激分子B7-1、B7-2、CD40和CD40L,故MSCs不能被異體T細(xì)胞所識(shí)別。②與MSCs劑量有關(guān),大劑量MSCs抑制而小劑量刺激T細(xì)胞增殖,可能是一種超負(fù)荷機(jī)制,而與主要組織相容性關(guān)系不大。③與MSCs產(chǎn)生的細(xì)胞因子有關(guān),如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1,因?yàn)椴捎靡环N半滲透膜將MSCs與淋巴細(xì)胞隔離,淋巴細(xì)胞的增殖仍受到抑制;也有學(xué)者認(rèn)為與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1無(wú)關(guān),在不同條件下,一些細(xì)胞因子,如白介素2、可溶性白介素2受體、白介素10、CD2、白細(xì)胞功能抗原3的表達(dá)增加、減少或不變,提示不同環(huán)境下有不同機(jī)制,其關(guān)鍵可能還在這些因子的下游區(qū)。上述爭(zhēng)論說(shuō)明MSCs的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚,在實(shí)驗(yàn)中我們推測(cè),可能是MSCs參與分泌的一些可溶性因子隨腦脊液循環(huán)入血,繼而發(fā)揮免疫