精子頂體蛋白的功能及檢測(cè)方法

精子頂體蛋白的功能及檢測(cè)方法

為了預(yù)測(cè)雄性動(dòng)物的繁殖能力，傳統(tǒng)的精子分析只根據(jù)精子濃度、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和形狀等參數(shù)進(jìn)行。然而，試驗(yàn)結(jié)果表明，這些質(zhì)量參數(shù)有限，不能作為評(píng)價(jià)仔豬性能的可靠預(yù)測(cè)值。評(píng)價(jià)精子功能的試驗(yàn)包括ATP的含量測(cè)定,子宮頸黏膜穿過(guò),精子透明帶穿過(guò),頂體膜完整性以及頂體蛋白測(cè)定等。通常,這些精子功能測(cè)試費(fèi)時(shí)或需要特殊的設(shè)備,限制了臨床和牧場(chǎng)的應(yīng)用。試驗(yàn)證明,透明帶是精子頂體蛋白自然的底物,純凈的頂體蛋白能消化哺乳動(dòng)物的透明帶,此外抗頂體蛋白單克隆抗體能抑制受精。頂體蛋白活性普遍地用作預(yù)測(cè)受精,而且頂體蛋白活性不能由其他的精液特征值預(yù)測(cè)。近年來(lái),許多研究?jī)?yōu)化了精子頂體蛋白測(cè)定的方法,這個(gè)方法既簡(jiǎn)便又能預(yù)測(cè)雄畜繁殖力及估測(cè)體外受精率。1確定了“中被確定的算法中,單次被確定基因克隆編碼頂體蛋白的基因已經(jīng)在人、小鼠和大白鼠中被確定。頂體蛋白基因5個(gè)外顯子被4個(gè)內(nèi)含子中斷,頂體蛋白基因被分配到人類的22號(hào)染色體、小鼠的15號(hào)染色體、大白鼠的7號(hào)染色體和豬的15號(hào)染色體。2透明帶糖蛋白的激活及調(diào)節(jié)28ku頂體蛋白幫助維持頂體基質(zhì)的完整性和控制頂體蛋白從頂體反應(yīng)的細(xì)胞中釋放。前頂體蛋白只是絲氨酸蛋白水解酶家族的一個(gè)成員。前頂體蛋白的主要結(jié)構(gòu)可以劃分成3個(gè)區(qū)域。結(jié)構(gòu)域Ⅰ編碼輕鏈的氨基酸;結(jié)構(gòu)域Ⅱ具有重鏈的羧基末端區(qū)域,這個(gè)區(qū)域在絲氨酸蛋白水解酶超家族其他成員中不存在。它的獨(dú)特之處是因?yàn)楹懈吒彼?。TopferPetersenE等指出在精子內(nèi)部前頂體蛋白與頂體蛋白間轉(zhuǎn)化在精子和透明帶接觸面被調(diào)節(jié)。一旦前頂體蛋白被激活,隨后β-頂體蛋白被釋放到細(xì)胞外的介質(zhì)中。前頂體蛋白和β頂體蛋白以同等的親和力與溶解的透明帶糖蛋白(ZPGs)結(jié)合。這種結(jié)合包括前頂體蛋白/頂體蛋白表面的堿基與ZPGs上聚硫酸鹽類的離子鍵結(jié)合。似乎前頂體蛋白/頂體蛋白和這些多聚硫酸鹽類的相互作用牽涉到硫酸鹽側(cè)鏈的特異性識(shí)別。MorenoRD等指出聚硫酸鹽類和ZPGs誘導(dǎo)前頂體蛋白活化,而后它們結(jié)合到酶的多聚硫酸鹽結(jié)合區(qū)域。然而,它們也抑制β-頂體蛋白酶的活性。聚硫酸鹽結(jié)合區(qū)域是在分子表面,但不包含活性部位。3公豬頂體蛋白的結(jié)構(gòu)組成所有哺乳動(dòng)物的卵都是被細(xì)胞外基質(zhì)即透明帶包圍著,以小鼠為例,ZP是由3個(gè)主要的硫酸鹽糖蛋白,即mZP1,mZP2,mZP3組成。當(dāng)前證據(jù)表明,在mZP3上O-連接寡糖,組成調(diào)節(jié)頂體完整的精子結(jié)合到透明帶表面的主要受體,然而mZP2的功能是作為次級(jí)受體固定頂體反應(yīng)的精子。mZP1被認(rèn)為具有許多結(jié)構(gòu)角色,前頂體蛋白/頂體蛋白非酶地結(jié)合到ZP糖蛋白上,在ZP糖蛋白的聚硫酸鹽類和前頂體蛋白基本的殘基之間的結(jié)合是一個(gè)強(qiáng)的離子交互作用。反應(yīng)物的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)至關(guān)重要,并決定結(jié)合親和力的一個(gè)較大范圍。公豬頂體蛋白定點(diǎn)誘變和3羧肽酶結(jié)構(gòu)分析確定在結(jié)合物中有效的基本殘基為2條。前頂體蛋白是一個(gè)具有重要作用的多功能蛋白,能維持ZP表面精子頂體反應(yīng),使其有足夠長(zhǎng)時(shí)間穿過(guò)ZP。然而,結(jié)合不必要很堅(jiān)固,否則會(huì)妨礙精子頭部穿過(guò)ZP。精子部分穿透力來(lái)自鞭毛運(yùn)動(dòng),另一部分穿透力來(lái)自不明的細(xì)胞溶解酶樣物的作用,精子頭穿過(guò)ZP到達(dá)卵細(xì)胞周隙,第3步結(jié)合接著發(fā)生,可能與卵膜上的整合素或CD9受體結(jié)合。4頂體蛋白活性哺乳動(dòng)物受精過(guò)程中,精子必須通過(guò)卵泡的顆粒細(xì)胞,穿過(guò)透明帶,最后和卵母細(xì)胞融合一體。受精的精子需要極度活躍才能通過(guò)頂體反應(yīng)釋放或暴露可以穿越透明帶的頂體蛋白,最終達(dá)到配子融合。在精子穿越卵丘細(xì)胞與透明帶結(jié)合時(shí),頂體蛋白起著重要的作用。頂體蛋白最初合成作為前蛋白源,并且被運(yùn)輸?shù)讲溉閯?dòng)物精子頂體中作為無(wú)活性酶的形式——前頂體蛋白而存在。除了具有蛋白水解酶的活性,頂體蛋白和它的前頂體蛋白還具有結(jié)合透明帶上糖蛋白類糖基的能力,還可以利用L-海藻糖和D-甘露糖合成新的糖蛋白。這種酶通過(guò)參與透明帶的水解,在頂體反應(yīng)中調(diào)節(jié)頂體成分的釋放,識(shí)別同源透明帶糖蛋白,包括精卵的交互作用。近年來(lái),結(jié)合生化、遺傳和實(shí)驗(yàn)的有利數(shù)據(jù)支持這樣一種假說(shuō),前頂體蛋白是一種多功能的蛋白,對(duì)維持透明帶表面精子的頂體反應(yīng),使其有足夠的時(shí)間穿過(guò)透明帶具有重要的意義。頂體蛋白表現(xiàn)兩個(gè)不同的活性:①酶的活性,如胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白水解酶;②植物凝血素樣碳水化合物結(jié)合活性。因此,頂體蛋白被假定具有限制透明帶蛋白酶解和維持頂體反應(yīng)的精子結(jié)合到透明帶兩種功能。另外,頂體蛋白活性對(duì)哺乳動(dòng)物精子與卵膜的融合發(fā)育是重要的。幾個(gè)臨床研究表明,在人體外受精處理時(shí),精子的受精潛能,正常形態(tài)精子的數(shù)量與精子頂體蛋白活性有很強(qiáng)的相關(guān)性?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)頂體蛋白活性與受精率呈現(xiàn)正相關(guān)。FrancavillaS等指出頂體蛋白活性的測(cè)定對(duì)檢測(cè)精子的功能病癥具有特殊意義。有學(xué)者報(bào)道,對(duì)于臨床評(píng)價(jià)雄性原因不同的不育,總的頂體蛋白活性可以當(dāng)作靈敏的生物化學(xué)的標(biāo)記。精子頂體蛋白分析能幫助預(yù)測(cè)精子受精能力。5頂體蛋白的抑制活性在許多臨床研究中,頂體蛋白的活性測(cè)定已經(jīng)被應(yīng)用于人類精液。這些研究結(jié)果表明,臨床測(cè)定能夠提供關(guān)于精液品質(zhì)方面有價(jià)值的信息。傳統(tǒng)上,對(duì)頂體蛋白活性的幾個(gè)測(cè)定方法已經(jīng)應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)室,包括放射免疫測(cè)定(RIA),應(yīng)用熒光測(cè)定的酶法(FEM)和液化明膠技術(shù)。但是這些方法很復(fù)雜并耗費(fèi)時(shí)間。后來(lái),檢測(cè)方法由BlackwellJ等進(jìn)行了改進(jìn)。ValdiviaM等報(bào)道,應(yīng)用三抗頂體蛋白單克隆抗體(ACROA8CiO,ACROC2BiO和ACROC5FiO)作為抑制劑來(lái)抑制頂體蛋白的活性?，F(xiàn)在評(píng)估人類精子活性是測(cè)定苯甲脒敏感的精氨酸酰胺酶的活性,提出假定全部或幾乎所有這種活性都因?yàn)轫旙w蛋白的存在。KennedyWP等報(bào)道,他們從來(lái)沒(méi)獲得任何證據(jù)證明,在人類精子中有其他苯甲脒敏感精氨酸酰胺酶或苯甲脒敏感精氨酸脂酶的存在。其他幾個(gè)實(shí)驗(yàn)也已提出,除了頂體蛋白,還有其他胰島素樣酶與精子有關(guān),但是缺乏有利證據(jù)說(shuō)明。例如,JohnsonRA等報(bào)道,公牛精子擁有一種名為水合茚三酮的酶,活性與頂體蛋白相似,通過(guò)相同的因子抑制其活性。KennedyWP等指出,沒(méi)有令人信服的證據(jù)證明,除了頂體蛋白精子有其他任何苯甲脒敏感精氨酸酰胺酶,因此他們已經(jīng)發(fā)明一個(gè)簡(jiǎn)單的方法測(cè)定人精子全部頂體蛋白活性。這個(gè)測(cè)定方法包括3個(gè)步驟,首先,將人的精液在Ficoll中通過(guò)離心的方法除去精清