細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的系統(tǒng)生物技術(shù)

報(bào)告內(nèi)容紫杉醇的藥源問(wèn)題蛋白質(zhì)組研究代謝組研究合成生物學(xué)研究概述1958,美國(guó)NCI開(kāi)始篩選新型抗腫瘤藥物研究計(jì)劃;美國(guó)化學(xué)家Wani和Wall于1971年從太平洋紅豆杉樹(shù)皮中提取到一種抗腫瘤物質(zhì)紫杉醇。紫杉醇的發(fā)現(xiàn)

與β微管蛋白

N

端第31位、217~231位氨基酸結(jié)合，抑制微管解聚，抑制有絲分裂，阻滯細(xì)胞周期于G2/M期,使癌細(xì)胞死亡。紫杉醇作用機(jī)理:概述(1979年)概述1992年FDA批準(zhǔn)紫杉醇2006年FDA批準(zhǔn)多烯紫杉醇晚期乳腺癌,晚期非小細(xì)胞肺癌晚期卵巢癌,胰腺癌、頭頸癌胃癌,前列腺癌概述紫杉醇與多烯紫杉醇H(CH3)3CO紫杉醇原料來(lái)源1)天然紅豆杉植物提取法概述2)化學(xué)全合成(2)Nicoloau路線----會(huì)聚式

A環(huán)和C環(huán)→八元B環(huán)，得到ABC三環(huán)化合物。(3)Danishefsky路線----會(huì)聚式

D環(huán)→與A和C、D環(huán)片段連接，合成八元B環(huán)。

Holton路線----線性途徑

A→AB→ABC。3)半合成紫杉醇側(cè)鏈：化學(xué)合成；(2R,3S)-3-N-苯甲?；?

苯基異絲氨酸避免了合成紫杉醇復(fù)雜的母環(huán)部分母核：紅豆杉針葉中提取巴卡亭III（R=Ac）或10-去乙?；涂ㄍII（10-DAB，R=H）※

紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)※

2004年6月28日，Bristol-MyersSquibb獲總統(tǒng)綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎(jiǎng)。4)生物工程方法概述細(xì)胞生長(zhǎng)與紫杉醇合成關(guān)系:非偶聯(lián)高產(chǎn)措施:誘導(dǎo)子:稀土鈰離子/真菌多糖/甲基茉莉酸培養(yǎng)策略:前體飼喂/兩相培養(yǎng)等紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇是很有潛力的技術(shù),需要解析微觀生物過(guò)程.形態(tài)變化:細(xì)胞分化與紫杉醇生產(chǎn)細(xì)胞應(yīng)答機(jī)理:

活性氧迸發(fā)刺激紫杉醇合成,同時(shí)引起細(xì)胞凋亡微環(huán)境剪切力場(chǎng)現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵問(wèn)題手段:測(cè)序技術(shù)革命,NMR,GC-MS,LC-MS,2DE-MS,基因組轉(zhuǎn)錄組蛋白質(zhì)組代謝組系統(tǒng)生物技術(shù)DNADatabasesCompare,cluster,integrateNewTheory:structureandfunctionNewApplication:industrialprocessimprovement數(shù)據(jù)有待積累理論有待建立最終必將突破高通量解析工業(yè)生物過(guò)程基因組+轉(zhuǎn)錄組回答為什么WHY蛋白質(zhì)組回答如何進(jìn)行HOW代謝組回答是什么WHAT回答工業(yè)過(guò)程的三個(gè)基本問(wèn)題ProteomicsMetabolomicsLipidomics微環(huán)境:固定化?:15mmh:15mm固定化提高了紫杉醇的產(chǎn)量固定化不同區(qū)域的細(xì)胞活性與產(chǎn)量的關(guān)系紫杉醇合成活力：由外層到核心增加細(xì)胞活力：由外層到核心降低固定化細(xì)胞出現(xiàn)分化：AGPs表達(dá)Susp.Immob.ChengJS,LeiC,WuJC,YuanYJ*.JournalofBiotechnology,2008,133(1):96-102.Susp.Immob.ERK-like磷酸化固定化細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控ChengJS,YinDM,YuanYJ*.EnzymeandMicrobialTechnology,2006,39(6):1250-1257固定化細(xì)胞對(duì)MAPlike-Kinases磷酸化響應(yīng)及調(diào)控作用ChengJS,YuanYJ*.BiotechnologyandAppliedBiochemistry,2006,44:109-117ChengJS,YuanYJ.Proteomics2006,6,2199-2007

2-DE和MS，細(xì)胞生長(zhǎng)、生產(chǎn)與固定化微環(huán)境作用的關(guān)系蛋白質(zhì)組。發(fā)現(xiàn)氮、硫和糖代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)與細(xì)胞分裂和次代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系為細(xì)胞培養(yǎng)方式選擇提供依據(jù)蛋白組分析方法揭示固定化細(xì)胞時(shí)空異質(zhì)性O(shè)xidativeresponseofcellsinducedbyshearstressHistochemicaldetectionofH2O2incellsbyDABstainingCelldeathwasevaluatedbyEvansBluestainingChangesoffouridentifiedproteinsinmediabasedon2-DFunctionalcategoriesofidentifiedproteinsby2-DLC-MS/MSFunctionalcategoriesofidentifiedproteinsby2-DLC-MS/MSJ-SCheng,Y-JYuan.JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic.2009,58:84–92MetaboliteprofilingofTaxuscellsinresponsetoshearstressbyGC-TOF-MSTotalionchromatogramsofTaxuscellsforGC-MSanalysis.(B)LoadingplotgeneratedfromPCAanalysis.(D)VIPplotfromPLSanalysis.MultivariateanalysisbyPCAandPLS.ScoreplotsfromPCA(A)andPLS(C).Variationsofintracellularmetabolitesundershearstress.Atotalof65intracellularmetabolitesMmetaboliteabundanceontothemetabolicnetwork.ShearstressinhibitingTCAcycleandNmetabolism.Co-inductionofglycolysisandaccumulationofcompatiblesolutes(a)得分圖(b)載荷圖PCA分析正常細(xì)胞和不同誘導(dǎo)子脅迫的誘導(dǎo)細(xì)胞MeJA和Ce4+誘導(dǎo)東北紅豆杉細(xì)胞磷脂酶的差異激活及下游脂質(zhì)信號(hào)分子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模型誘導(dǎo)子作用下紅豆杉細(xì)胞膜磷脂代謝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)PhospholipidomicsofTaxuscellsresponsingtoshearstressNegative-ionLC/ESI/MSbasepeakchromatogramofphospholipidsfromTaxuscells40haftershearstresstreatment.PG,phosphatidylglycerol;PE,phosphatidylethanolamine;

PC,phosphatidylcholine;

LysoPC,lysophosphatidylcholine.

PA,phosphatidicacid;PI,phosphatidylinositol;PS,phosphatidylserine;Phospholipidcontentsinshearstress-inducedTaxuscells.ScoreplotsfromPCA(A)andPLS(C).(B)LoadingplotfromPCA.(D)VIPplotfromPLS.MultivariateanalysisbyPCAandPLS.LysoPCChangesofbiomarkerphospholipidsPAP-PHanandY-JYuan.FASEBJ.200923:623-630.ActivationofphospholipaseD

ActivationofphospholipaseCDefiningtheenzymaticsourceofPA.AnalysisoflipidomicsofTaxuscells

inresponsetoshearstressPhospholipidcontentsinshearstress-inducedT.cells.Decreasetotalphospholipids,StructuralphospholipidssuchasPG,PE,andPCSterolsprofilesofT.cellsFattyacidsprofilesinT.cellsVariationsoffattyacidsundershearstress.Increasevery-long-chainsaturatedFAIncreasemonounsaturatedFADecreaseshortchainsaturatedFASchematicchangesofsterolabundanceontotheplantsterolbiosyntheticpathway.Theratiosofcampesterol:sitosterol,stigmasterol:sitosterol,andstigmasterol:campesterolinshearstress-inducedT.cells.IncreasestigmasterolattheexpenseofsitosterolandcampesterolTheratiosbetweensterolsandphospholipidsinshearstress-inducedT.cells.合成生物學(xué)（syntheticbiology）是基于生命系統(tǒng)的工程技術(shù)，旨在設(shè)計(jì)、構(gòu)建自然界不存在的生命或使已存在生命具有新功能。合成生物學(xué)研究如何設(shè)計(jì)和構(gòu)建人工生命，依靠人工開(kāi)發(fā)的基因密碼，按照預(yù)定的方式運(yùn)行生命。繼人類基因組研究之后，生物領(lǐng)域一熱門學(xué)科，是整體系統(tǒng)論生物學(xué)思潮在工程學(xué)領(lǐng)域的再現(xiàn)。

合成生物學(xué)SyntheticbiologyvscomputerassemblyProductionofpaclitaxelEngineeredE.coliforproductionofamorphadieneNatureBiotechnology

21,796-802(2003)byJayDKeasling4、EngineeredyeastforproductionofamorphadieneFPP積累：染色體水平修飾，tHMGR（雙拷貝）、ERG20

、upc2-1過(guò)表達(dá)，阻斷ERG9。ADS酵母表達(dá)，F(xiàn)PP轉(zhuǎn)化二烯。青蒿CYP71AV1+CPR共表達(dá)。2006年：Keasling

全新設(shè)計(jì)和合成了釀酒酵母中的青蒿素的代謝電路，成功實(shí)現(xiàn)了生產(chǎn)青蒿酸。