腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)脊髓損傷修復(fù)作用的電生理研究

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)脊髓損傷修復(fù)作用的電生理研究

經(jīng)過多年的研究，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bmsc）發(fā)現(xiàn)了多向分化潛力。離體培養(yǎng)BMSCs并使之增殖并分化為神經(jīng)細(xì)胞成為目前的研究熱點(diǎn)。脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種嚴(yán)重的創(chuàng)傷性疾病,脊髓損傷后神經(jīng)纖維難以再生是導(dǎo)致?lián)p傷后修復(fù)困難的重要原因。神經(jīng)纖維再生障礙的主要原因是損傷形成了一個(gè)不利于軸突生長的微環(huán)境,通常會(huì)引起抑制軸突生長和促進(jìn)軸突生長因素之間的失衡。因而,對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)保護(hù)及再生方面仍是一個(gè)難題和亟待解決的問題,選擇合適的治療手段來促進(jìn)脊髓損傷后的修復(fù)是治療脊髓損傷的重要方法。本研究目的是將BDNF基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到大鼠損傷脊髓內(nèi),探討細(xì)胞移植治療脊髓損傷的是否可行,運(yùn)用體感誘發(fā)電位技術(shù)(somatosensoryevokedpotential,SEP)和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(motorevokedpotential,MEP)技術(shù)等電生理檢測手段來觀察實(shí)驗(yàn)效果,為骨髓干細(xì)胞移植治療脊髓損傷將來應(yīng)用于臨床提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1培養(yǎng)基和培養(yǎng)基青鏈霉素混合液(中杉金橋,中國北京)、BTXECM830電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(BTX公司,美國)、無支原體胎牛血清(杭州四季青,中國浙江)、G418(Amresco公司,美國)、L-glucoseDMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Sigma,美國)、膠原酶Ⅳ(Sigma,美國)、倒置顯微鏡(O-lympus,日本)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司,美國)。1.1.2術(shù)后細(xì)胞移植清潔級(jí)成年SD大鼠30只,雌雄不拘,體重250~270g,購自山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(魯)2011-0003】。隨機(jī)將大鼠分成3組:空白組10只(只切除椎板,暴露脊髓硬脊膜);SCI組10只(進(jìn)行SEP、MEP)檢測;SCI術(shù)后細(xì)胞移植組10只;從每組中隨機(jī)抽取8只于細(xì)胞移植后1d、7d、14d、21d、30d、60d進(jìn)行檢測。具體操作參考。1.2麻醉狀態(tài)1.2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法、大鼠脊髓半橫斷損傷模型制作方法詳見。1.2.3細(xì)胞移植及其組織學(xué)觀察用微量注射器抽取經(jīng)BrdU標(biāo)記的總細(xì)胞數(shù)約為6×105細(xì)胞懸液,將針頭以45度斜角向下緩慢注入到脊髓損傷臨近區(qū)域的灰白質(zhì)交界處(約距脊髓表面0.5mm),注射時(shí)間約持續(xù)l0min,注射完畢留針5min,針取出后,注射孔用醫(yī)用生物蛋白膠封閉。對(duì)照組按照同樣操作步驟注射與細(xì)胞懸液等量PBS緩沖液。電生理檢測后(1d、7d、14d、21d、30d、60d)灌注固定觀察移植后細(xì)胞存活情況(另文報(bào)道)。1.2.4皮層體感誘發(fā)電位(SEP)檢查造模前從各組隨機(jī)抽取8只,對(duì)造模前以及造模后1d、7d、14d、21d、30d、60d行CSEP檢查。動(dòng)物用10%水合氯醛(3mL/kg)腹腔注射致淺麻醉狀態(tài):角膜反射消失,呼吸勻稱,節(jié)律規(guī)整。俯臥位固定于立體定位架上,先暴露大鼠右側(cè)大腦感覺皮層,并在其表面安置記錄電極,左額皮下插入?yún)⒖茧姌O;再分離暴露大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng),將坐骨神經(jīng)置于勾狀雙極電極,周圍用石蠟油棉球包裹絕緣。坐骨神經(jīng)給予電刺激,刺激強(qiáng)度5.0V,波形寬度0.1ms,刺激頻率10Hz。濾波帶通300Hz,串刺激10次,信號(hào)經(jīng)放大器放大后,電腦采集并儲(chǔ)存待分析。1.2.5運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(MEP)檢查造模前從各組隨機(jī)抽取8只,對(duì)造模前以及造模后1d、7d、14d、21d、30d、60d行MEP檢測。10%水合氯醛(3mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠,具體操作方法同上。待大鼠麻醉后,俯臥位固定于立體定位架上。暴露右側(cè)大腦感覺運(yùn)動(dòng)皮層將一枚銀球電極(陰極)置于其上,T12脊髓背側(cè)硬膜表面放置記錄電極;另外在硬腭黏膜下(陽極)和T12鄰近椎旁肌肉放置參考電極,接地電極置于大鼠頸部皮下。給予皮層單個(gè)電刺激,刺激強(qiáng)度5.0V,波幅寬度0.1ms,刺激頻率10Hz,每次記錄10個(gè)完整波形,放大器放大信號(hào)后收集儲(chǔ)存待分析。1.2.6運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分(BBB評(píng)分)造模結(jié)束后由不知情者按以下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物損傷側(cè)后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):損傷側(cè)沒有運(yùn)動(dòng),且該側(cè)后肢肌力為零記為0分;損傷側(cè)后肢有輕微運(yùn)動(dòng),但不能負(fù)重記為1分;損傷側(cè)后肢有明顯運(yùn)動(dòng),但不能負(fù)重記為2分;損傷側(cè)能行走數(shù)步,但不持久記為3分;能緩慢行走,但步態(tài)不穩(wěn)記為4分;正常行走記為5分。1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理記錄各組BBB評(píng)分、SEP及MEP數(shù)據(jù),分別采用SPSS17.0軟件包處理,樣本均數(shù)采用(ue0af±s)表示,采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析各組數(shù)據(jù)。2結(jié)果2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞折光能力的測定全骨髓接種到培養(yǎng)瓶中,5%CO2培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)7d,除去培養(yǎng)液中懸浮細(xì)胞,只留貼壁的圓形細(xì)胞,此細(xì)胞即為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,新生的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞折光能力很強(qiáng);隨著換液,細(xì)胞逐漸呈集落性生長(圖1A),細(xì)胞形態(tài)也開始發(fā)生變化,由最初的類圓形轉(zhuǎn)變近似梭型,大約取材后的12d左右,原代細(xì)胞增殖至密度大于85%,即可進(jìn)行細(xì)胞傳代。2.2不同細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后,大部分細(xì)胞形態(tài)較一致,但是部分細(xì)胞死亡。沒有成功轉(zhuǎn)染基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在G418篩選的過程中逐漸死亡,轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞生長狀態(tài)良好(圖1B,彩插13)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞數(shù)量較轉(zhuǎn)染前減少,生長周期較轉(zhuǎn)染前放緩,但細(xì)胞形態(tài)稍有增大,胞體突起數(shù)量增多(圖2,彩插13)。2.3術(shù)后肌張力及運(yùn)動(dòng)變化過程術(shù)后8h,所有大鼠完全清醒,除空白組大鼠外其他兩組所有受試鼠均出現(xiàn)脊髓休克綜合征,術(shù)后前3d自主活動(dòng)及飲食較損傷前均減少,伴有輕度尿儲(chǔ)留,肌張力低,損傷側(cè)肌力0級(jí),損傷對(duì)側(cè)肌力較正常明顯減弱。細(xì)胞移植術(shù)4~7d,飲食、活動(dòng)稍增加,損傷后,大鼠后肢肌張力和運(yùn)動(dòng)變化過程如下:1~4d損傷側(cè)后肢遲緩性癱瘓,拖地行走,損傷對(duì)側(cè)后肢由損傷初期的運(yùn)動(dòng)減弱逐漸恢復(fù),損傷后5~9d損傷側(cè)后肢痙攣性癱瘓;10~14d損傷側(cè)下肢恢復(fù)少量活動(dòng),損傷對(duì)側(cè)后肢恢復(fù)至較損傷前稍弱的狀態(tài);15~21d損傷側(cè)后肢活動(dòng)能力較之前有明顯改善,至30d損傷側(cè)后肢活動(dòng)能力及肌張力恢復(fù)程度最明顯,30d以后無更明顯改善。2.4組患者csep和mep刑期恢復(fù)情況比較各組動(dòng)物處理前后皮層誘發(fā)電位和動(dòng)作誘發(fā)電位的峰值和潛伏期的動(dòng)態(tài)變化分別見表1~4。運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分參見表5。由表1~4可知:脊髓損傷術(shù)后1d,移植組、SCI組與空白組比較:CSEP和MEP潛伏期延長,波幅降低,差異具有顯著性(P<0.05);由表2和表4可知:脊髓損傷術(shù)后14d及以后,移植組較SCI組:CSEP和MEP潛伏期恢復(fù)程度有顯著差異(P<0.05);由表5可知:脊髓損傷14d以后,移植組較單純損傷組BBB評(píng)分在有顯著提高(P<0.05)。3神經(jīng)營養(yǎng)因子及神經(jīng)電生理指標(biāo)的變化骨髓MSCs具有易于取材、分離培養(yǎng)和體外擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn),無免疫排斥反應(yīng)并可自體移植,在特定條件下可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)、骨、軟骨、肝、心肌等多種細(xì)胞。因此我們在以往的實(shí)驗(yàn)中選用不同誘導(dǎo)劑和誘導(dǎo)方法將MSCs向神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),均取得較理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。我們在實(shí)驗(yàn)中將誘導(dǎo)標(biāo)記后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞直接移植入脊髓損傷處,發(fā)現(xiàn)這種方法較尾靜脈注射移植、腦脊液注射移植等方法既可以準(zhǔn)確的控制干細(xì)胞遷移和趨行部位,又能增加損傷處細(xì)胞數(shù)量。我們的研究表明,脊髓損傷的大鼠在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植4d以后大鼠攝食和活動(dòng)均開始有所改善,損傷側(cè)后肢肌張力也有輕微改善,損傷后大鼠肌張力和運(yùn)動(dòng)變化如下:1~4d損傷側(cè)后肢遲緩性癱瘓,拖地行走,損傷對(duì)側(cè)后肢由損傷初期的運(yùn)動(dòng)減弱逐漸開始恢復(fù),損傷后5~9d損傷側(cè)后肢痙攣性癱瘓;10~14d損傷側(cè)下肢開始恢復(fù)少量活動(dòng),損傷對(duì)側(cè)后肢恢復(fù)至較損傷前稍弱的狀態(tài);15~21d損傷側(cè)后肢活動(dòng)能力較之前有明顯改善。至30d損傷側(cè)后肢活動(dòng)能力及肌張力恢復(fù)程度最明顯,30d以后無更明顯改善通過免疫組織化學(xué)(另文報(bào)道)檢測表明移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能在脊髓損傷處存活。根據(jù)行為學(xué)觀察,脊髓損傷移植治療后大鼠的運(yùn)動(dòng)功能有較明顯改善。MSCs移植后自身可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子,并促進(jìn)宿主分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子,從而營養(yǎng)和保護(hù)神經(jīng)。BD-NF是一種自泌性促神經(jīng)生長因子,主要在神經(jīng)元的胞體內(nèi)合成,通過自分泌的方式與它自身的受體相結(jié)合,從而對(duì)神經(jīng)元發(fā)揮廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)作用,并能夠促進(jìn)神經(jīng)元存活、分化及功能表達(dá),也能挽救損傷的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和感覺神經(jīng)元是促進(jìn)神經(jīng)元分化以及髓鞘形成不可缺少的神經(jīng)營養(yǎng)因子。有研究表明,BDNF能促進(jìn)神經(jīng)存活,增加其的表達(dá)對(duì)缺血周圍區(qū)的損傷修復(fù)有重要的促進(jìn)作用,另外,BDNF還能通過調(diào)節(jié)突觸傳遞及其可塑性來促進(jìn)樹突和軸突的生長并發(fā)揮抑制神經(jīng)元凋亡等作用。有研究發(fā)現(xiàn),通過電針治療后,BDNF的合成在損傷處有顯著提高,這可能是促進(jìn)神經(jīng)再生的有效途徑。而BDNF有可能是通過受體激酶促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活和分化從而實(shí)現(xiàn)膽堿能神經(jīng)元在體內(nèi)或者體外培養(yǎng)時(shí)的存活和分化,最終發(fā)揮促進(jìn)受損神經(jīng)的修復(fù)的作用。Gu等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在脊髓損傷動(dòng)物脊髓中觀察到很少移植的BMSCs分化為神經(jīng)元樣或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞,但是在致傷后第6周、第8周觀察到移植組脊髓損傷空洞的體積明顯小于對(duì)照組。僅靠影像學(xué)等輔助檢查往往難以準(zhǔn)確判斷和評(píng)估脊髓損傷后脊髓的神經(jīng)功能及其恢復(fù)情況。臨床通常用神經(jīng)電生理指標(biāo)檢測和評(píng)價(jià)損傷后脊髓神經(jīng)的傳導(dǎo)功能。最常用的指標(biāo)包括皮層體感誘發(fā)電位和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位。皮層體感誘發(fā)電位主要沿本體感覺通路的有髓纖維傳導(dǎo),由神經(jīng)節(jié)、薄束、楔束核和三級(jí)神經(jīng)元組成,通常用來反映本體感覺通路功能狀況和結(jié)構(gòu)完整性。我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),切斷左側(cè)脊髓后,左側(cè)皮層體感誘發(fā)電位波幅明顯下降,潛伏期明顯延長,而右側(cè)基本正常。我們還觀察到:脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)情況與皮層體感誘發(fā)電位恢復(fù)快慢有一定的關(guān)聯(lián),傷后短期內(nèi),運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)較佳者,其皮層體感誘發(fā)電位也出現(xiàn)較好恢復(fù)。運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位主要用來檢測運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)的完整性和反映脊髓損傷的嚴(yán)重程度。損傷脊髓不同部位后,運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位表現(xiàn)截然不同,我們發(fā)現(xiàn):切斷大鼠左側(cè)脊髓,左側(cè)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位無法引出,而右側(cè)正常。我們還發(fā)現(xiàn):保留脊髓前索白質(zhì)神經(jīng)纖維,運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位均可引出,而破壞前索纖維者,運(yùn)動(dòng)電位難以引出,運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位的表現(xiàn)與脊髓破壞程度一致;損傷后,短期內(nèi)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位有較快恢復(fù)者,其運(yùn)動(dòng)功能往往也恢復(fù)很好。形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位的變化趨勢與組織學(xué)改變有較好的一致性。對(duì)不完全性的脊髓損傷,潛伏期越長,波幅越低,脊髓病變程度往往越嚴(yán)重。分析其原因可能為白質(zhì)纖維發(fā)生脫髓鞘病變,從而導(dǎo)致纖維傳導(dǎo)速度下降,另外位于脊髓前角的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞興奮性降低導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位刺激強(qiáng)度閾值增高也可能是形成因素。本研究發(fā)現(xiàn)可以通過觀察動(dòng)物的皮層體感誘發(fā)電位和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位的潛伏期、波幅粗略判斷脊髓損傷后動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能的缺失程度及預(yù)后。但是脊髓損傷后,皮層體感誘發(fā)電位和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位的傳導(dǎo)通路以及誘導(dǎo)的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步的探究。1.2.2pIRESneo-EGFP-BDNF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓MSCs待第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞融合度達(dá)到50%~60%時(shí),PBS沖洗三遍,0.125%胰酶,37℃消化3min,L