dna甲基化的研究進(jìn)展

dna甲基化的研究進(jìn)展

表觀遺傳是指基因的不改變，表型中基因的改變和機(jī)制。包含了3項(xiàng)基本特征:遺傳性,指這些表觀修飾在增殖中可以穩(wěn)定遺傳;可逆性,即表觀遺傳對基因表達(dá)的影響可控制或解除;非DNA序列的變化,即核苷酸序列不變,而是通過序列的修飾影響基因表達(dá)。表觀遺傳學(xué)修飾主要表現(xiàn)形式有:DNA甲基化,染色質(zhì)重組,組蛋白修飾,核小體的重塑。這些表觀修飾通過調(diào)控基因的表達(dá)而在細(xì)胞中形成獨(dú)特的表型,影響細(xì)胞基因的表達(dá),并將此影響隨細(xì)胞分裂而遺傳下去。因此,表觀修飾是一類高于基因水平的基因調(diào)控機(jī)制,是將基因型與表型聯(lián)系起來的紐帶。DNA甲基化是基因主要的表觀遺傳修飾形式,是調(diào)節(jié)基因組功能的重要機(jī)制,與人類胚胎的發(fā)育分化密切相關(guān)。其作用體現(xiàn)在多種遺傳現(xiàn)象上,包括:基因組印記,基因沉默,X染色體失活等。DNA甲基化的形成機(jī)制DNA甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferases,DNMT)的催化下,以S2腺苷蛋氨酸(S2adenosylmethionine,SAM)作為供體將活化的甲基引入DNA鏈中。甲基化修飾有多種方式,即被修飾位點(diǎn)的堿基可以是腺嘌呤的N26位、胞嘧啶的N24位、胞嘧啶的C25位以及鳥嘌呤的N27位。在哺乳動物細(xì)胞的基因組DNA中,約4%胞嘧啶是以5-甲基胞嘧啶形式存在的,這是最常見的甲基化形式。而CpG二核苷酸是DNA甲基化發(fā)生的主要位點(diǎn)。在位于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)附近基化區(qū),常成簇存在著富含CpG的DNA片段,約每10bp就出現(xiàn)一個CpG位點(diǎn),通常長度在1~2kb左右,稱為CpG島。CpG島一般位于基因的啟動子區(qū),有時還包括基因5′端的外顯子和內(nèi)含子,與基因5′端密切相關(guān)。健康人基因組中CpG島中的CpG位點(diǎn)通常處于非甲基化狀態(tài),而在CpG島外的CpG位點(diǎn)則通常是甲基化的。DNA的甲基化主要是受到DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族的調(diào)控。哺乳動物的DNMT的催化區(qū)域中存在保守序列含500個氨基酸殘基,是催化CpG島甲基化的活性部位,催化的具體機(jī)制為:首先識別并將待甲基化的CpG移至甲基化酶的所謂催化袋(pocket)中,此后酶催化域中的半胱氨酸和待甲基化的胞嘧啶6位在酶的催化作用下形成共價鍵,與此同時,SAM在甲基化酶的催化下將甲基轉(zhuǎn)移到被激活的胞嘧啶5位上;最后,胞嘧啶6位的共價鍵斷裂,5位的質(zhì)子釋放,而SAM變成S腺苷高半胱氨酸。根據(jù)作用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶分2種:一種是重新甲基化酶,對于哺乳動物是Dnmt3a和Dnmt3b,是使原來沒有甲基化的DNA雙鏈上進(jìn)行甲基化。另一種是維持甲基化酶,對于哺乳動物即Dnmt1,其主要是催化復(fù)制后的半甲基化,也就是在Dnmt1的作用下根據(jù)親鏈上的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)的甲基化修飾的過程,使DNA分子未甲基化的那一條子鏈甲基化,從而保持子鏈與親鏈有完全相同的甲基化形式,重新甲基化完成后由維持甲基化來維持其穩(wěn)定的甲基化狀態(tài)。在細(xì)胞增殖分化的過程中,基因的甲基態(tài)將遺傳給后代。但哺乳動物生殖細(xì)胞在形成受精卵后的最初幾次卵裂中,發(fā)生DNA的去甲基化,即在去甲基化酶的作用下,去除DNA分子上幾乎所有從親代遺傳來的甲基化標(biāo)記,這是一種受到RNA分子調(diào)節(jié)的核酸替代的過程。此過程包括非特異性去甲基化和特異性去甲基化。胚胎早期的植入期前,整個基因組發(fā)生了普遍的非特異性去甲基化,非甲基化狀態(tài)保持到細(xì)胞的桑葚期前。此后的胚胎植入期間,組織特異性基因經(jīng)歷選擇性的特異性甲基化。因此,成體基因組通常呈現(xiàn)2種DNA甲基化形式,奢侈基因呈現(xiàn)高密度甲基化,而含有豐富CpG島的管家基因則呈非甲基化。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)新的甲基化模式形成后,即可通過甲基化酶以“甲基化維持”的形式將新的DNA甲基化傳遞給所有子細(xì)胞。最近Kaminsky等通過研究同卵和異卵雙胞胎基因的甲基化情況推斷,甲基化的遺傳機(jī)制和受精卵中的表觀遺傳差異有關(guān),而不僅由基因的序列決定。DNA甲基化對基因表達(dá)的調(diào)控DNA甲基化雖然未改變核苷酸順序及其組成,但普遍認(rèn)為可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá),尤其是轉(zhuǎn)錄起始階段,DNA甲基化也正通過這種方式發(fā)揮生物學(xué)作用。基因啟動子及其附近區(qū)域內(nèi)CpG島胞嘧啶甲基化是眾多基因?qū)崿F(xiàn)去表達(dá)和基因印跡的重要途徑。由于CpG島多位于啟動子附近區(qū)域,是轉(zhuǎn)錄的啟動區(qū),眾多轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合于DNA的大溝內(nèi),而甲基化的5-甲基胞嘧啶的甲基也位于此溝內(nèi),從而阻礙了蛋白質(zhì)因子與DNA間的結(jié)合。DNA甲基化還可通過影響DNA分子構(gòu)象影響基因上游調(diào)控區(qū)和基因轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用。有研究表明,E2F,AP2,MYC和YY1要求CpG提供結(jié)合位點(diǎn),其是甲基化依賴的轉(zhuǎn)錄因子,于是啟動子區(qū)的甲基化就通過阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結(jié)合的方式降低基因轉(zhuǎn)錄。此外,甲基化DNA位點(diǎn)還可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制子,如甲基化結(jié)合蛋白21(MeCP21)和MeCP22,引起基因沉默。轉(zhuǎn)錄抑制子對脊椎動物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄起始階段有抑制作用,對于某些真菌,轉(zhuǎn)錄抑制子還能阻斷其基因轉(zhuǎn)錄的延伸階段。近年還發(fā)現(xiàn),DNA甲基化可改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu),也可間接介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制。另外,DNA甲基化還可能通過降低RNA聚合酶活性而抑制基因的表達(dá)。Kangaspeska等最近研究發(fā)現(xiàn),在PS2等基因的DNA啟動子區(qū)存在短暫的周期性甲基化,這種周期現(xiàn)象與這些基因的一種低水平的再表達(dá)相一致。Métivier等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),通過抑制這一過程阻止了PS2基因的去甲基化進(jìn)而阻止了基因表達(dá)的活性。Erfurth等最近研究發(fā)現(xiàn),MLL蛋白具有防止Hoxa9CpG島甲基化的作用,并進(jìn)而影響了基因轉(zhuǎn)錄,提示應(yīng)該有更多的CpG島結(jié)合蛋白具有通過影響甲基化來保證基因轉(zhuǎn)錄水平的功能。DNA甲基化對基因的表達(dá)抑制需要特異地結(jié)合于CpG甲基化位點(diǎn)的MeCPs。MeCP1和MeCP2是目前研究較清楚的甲基化結(jié)合蛋白,兩者的作用有區(qū)別,前者可與對稱的多個CpG位點(diǎn)結(jié)合,而后者只能與單一的甲基化CpG位點(diǎn)結(jié)合。這種基因轉(zhuǎn)錄受到甲基化的抑制僅發(fā)生在啟動子區(qū),而非島區(qū)的CpG甲基化則不抑制基因的轉(zhuǎn)錄。對于啟動子區(qū),CpG甲基化的密度與基因轉(zhuǎn)錄的抑制程度呈正相關(guān)。甲基化密度較低時只能完全抑制弱的啟動子,而在增強(qiáng)子作用下時,啟動子便可恢復(fù)基因轉(zhuǎn)錄功能;但如果進(jìn)一步增加甲基化的密度,也可能完全抑制了被增強(qiáng)子增強(qiáng)的啟動子的轉(zhuǎn)錄。綜上,除有些始終非甲基化的組織特異性基因及對甲基化不敏感的基因外,甲基化的高低往往影響著基因表達(dá)的程度,通常呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,即甲基化水平較低時,基因表達(dá)水平較強(qiáng);反之,甲基化水平較高時,基因表達(dá)水平較低。基因啟動子及其附近區(qū)域內(nèi)CpG甲基化是眾多基因?qū)崿F(xiàn)去表達(dá)(沉默)和基因印跡的重要途徑,通過測定啟動子CpG島甲基化狀態(tài)了解基因是否去表達(dá),為在DNA水平研究基因表達(dá)提供重要途徑。DNA甲基化的研究方法CpG位點(diǎn)甲基化的分析測定方法根據(jù)研究目的主要可分為3類。研究基因組的總體甲基化水平。檢測基因組5-甲基胞嘧啶水平屬于早期的DNA甲基化分析技術(shù),主要包括5-甲基胞嘧啶免疫學(xué)抗體技術(shù)、MBD柱層層析、高效液相色譜、高效毛細(xì)管電泳、MSssI甲基轉(zhuǎn)移酶分析和氯乙醛反應(yīng)法等。檢測特異位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。分析特定基因或序列位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的分析技術(shù),包括甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)/DNA印跡法,甲基化特異性的PCR,甲基化敏感性單鏈構(gòu)象分析,直接測序法,重亞硫酸鹽限制酶組合分析,甲基化敏感性斑點(diǎn)分析,甲基化敏感性變性梯度凝膠電泳,甲基化敏感性單核苷酸引物延伸法,PCR熒光變性曲線分析,甲基化熒光檢測(Methylight),甲基化特異性多連接依賴性探針擴(kuò)增(MS-MLPA),基于寡核苷酸的微陣列法等。尋找新甲基化位點(diǎn)。DNA甲基化相關(guān)基因的篩選及新的甲基化位點(diǎn)尋找技術(shù),主要包括限制性標(biāo)記基因組掃描(RLGS)、甲基化間區(qū)位點(diǎn)擴(kuò)增、DNA甲基化微陣列技術(shù)和MBD柱層析技術(shù)等。DNA甲基化在婦產(chǎn)科疾病中的研究Bauting等早在1930年首次把異常甲基代謝和疾病的發(fā)生聯(lián)系起來。后研究者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),缺乏甲基的膳食可能導(dǎo)致體內(nèi)甲基供體不足以及DNA和特殊基因的異常甲基化,進(jìn)而引起神經(jīng)錯亂和先天缺陷等病理現(xiàn)象。此后,對DNA甲基化和甲基代謝方面的研究迅速增加。近年發(fā)現(xiàn),基因組DNA異常甲基化可能與多種疾病尤其是年齡相關(guān)慢性疾病的發(fā)生有關(guān),目前研究較多的是腫瘤。Ehrich等選取四百多個腫瘤相關(guān)基因并比較了腫瘤表型和正常表型下這些基因的甲基化情況。結(jié)果顯示,78個基因在腫瘤的表型下甲基化情況發(fā)生改變,其中有7個基因在各種不同形式的腫瘤中都表現(xiàn)出甲基化的異常。在婦產(chǎn)科腫瘤中亦已發(fā)現(xiàn)有許多癌變受癌相關(guān)基因甲基化的影響。Holm等最近在研究中發(fā)現(xiàn),不同的乳腺癌分子亞型與乳腺組織的DNA甲基化的差異有關(guān),這暗示甲基化在乳腺癌發(fā)生中起著重要作用。CelebilerCavusoglu等對P16和CDH1的研究表明,浸潤性乳腺癌的腫瘤組織和其周圍正常的乳腺組織在這兩個基因中的甲基化表達(dá)存在差異,而這種差異還存在于在腫瘤周圍的正常乳腺組織和無腫瘤的正常乳腺組織之間。Kioulafa等通過分析RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)發(fā)現(xiàn),57.0%早期乳腺癌患者中有RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化,提示RASSF1A甲基化可能是乳腺癌發(fā)生中的早期事件。Joensuu等研究發(fā)現(xiàn),在至少15%子宮內(nèi)膜癌中有CDH13,APC,GSTP1和TIMP3等4種腫瘤抑制基因發(fā)生甲基化,此外還發(fā)現(xiàn)RASSF1A甲基化與子宮內(nèi)膜癌密切相關(guān)。目前普遍認(rèn)為,腫瘤和正常細(xì)胞相比,甲基化水平發(fā)生了很大改變,具體表現(xiàn)為,在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中常出現(xiàn)整個基因組DNA的低甲基化和CpG島局部甲基化程度的異常升高。前者往往是由于腫瘤細(xì)胞中3種DNA甲基化酶活性增高或產(chǎn)生協(xié)同作用,或未甲基化的CpG島的局部保護(hù)機(jī)制受到破壞而引起,將導(dǎo)致染色體的不穩(wěn)定以及原癌基因的過度表達(dá);而后者則引起細(xì)胞周期調(diào)控基因(如Rb)、細(xì)胞凋亡基因(如CASP8)、DNA修復(fù)基因(如MGMT)、血管形成基因(如THBS1)等癌相關(guān)基因的沉默,從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。Bloushtain-Qimron等研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子FOXC1在CD44+細(xì)胞中的低甲基化和高表達(dá)誘導(dǎo)了分化的乳腺上皮細(xì)胞的祖細(xì)胞樣表型。Dumont等通過持續(xù)誘導(dǎo)乳腺癌中上皮向間葉組織分化的實(shí)驗(yàn)闡明,微環(huán)境中的信號能誘導(dǎo)表型和基因表達(dá)發(fā)生定向變化,而該變化與發(fā)生在腫瘤形成中的定向重頭甲基化改變密切相關(guān),鑒于這種發(fā)生在細(xì)胞中的動態(tài)表觀遺傳重建,人類腫瘤細(xì)胞中觀察到的DNA甲基化情況很可能反映了腫瘤起源時環(huán)境的變化。眾多研究表明,不同的微小RNA(microRNA,miRNA)在正常組織和衍生腫瘤及不同的腫瘤類型之間存在表達(dá)的差異,在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)的miRNA具有腫瘤抑制基因或原癌基因的特性。Lujambio等還發(fā)現(xiàn),這種差異還和腫瘤的轉(zhuǎn)移性有關(guān),而這種差異表達(dá)正是通過DNA的CpG島高甲基化導(dǎo)致具有腫瘤抑制因子特征的miRNA沉默實(shí)現(xiàn)的,這成為了人類腫瘤的一個共同標(biāo)志。目前干細(xì)胞學(xué)說是腫瘤發(fā)生研究中的一大熱點(diǎn)。近年諸多研究也預(yù)示著甲基化很可能在胚胎和腫瘤干細(xì)胞的性能中起到重要作用。Gereige等最近證實(shí),在Dnmt1的作用下,DNA甲基化通過干擾細(xì)胞再生和沉默多項(xiàng)分化潛能的程序而保護(hù)造血干細(xì)胞的基本干細(xì)胞特性。Doi等研究發(fā)現(xiàn),人為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞,胚胎干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中CpG島的組織特異性和腫瘤特異性甲基化的水平存在著顯著差異,很多差異甲基化區(qū)域在組織分化、表觀重建和乳腺癌等多種腫瘤發(fā)生中起重要作用。DNA甲基化的研究展望近年隨著對表觀遺傳研究的深入,逐漸認(rèn)識到甲基化差異在基因調(diào)控、表型傳遞和胚胎發(fā)育中起到的重要作用,為眾多疾病研究和治療提供了方向。然而除腫瘤外,對DNA甲基化與其他疾病關(guān)系研究目前還主要處于萌芽狀態(tài)。有研究表明,多種泌尿生殖系統(tǒng)疾病與性激素相關(guān)基因的甲基化異常有關(guān),例如雄激素非依賴型前列腺癌中,雄激素受體(AR)的基因啟動子區(qū)域異常高甲基化在AR表達(dá)中起關(guān)鍵作用,而AR表達(dá)喪失可導(dǎo)致激素非依賴型前列腺癌的發(fā)生。泌尿生殖系腫瘤中部分雌激素受體A-6(ERa-6)表達(dá)或表達(dá)減少,與ERa基因啟動子CpG島高度甲基化有關(guān)。多囊卵巢綜合征(PCOS)是婦科發(fā)病率很高的疾病,是中國女性不孕癥重要原因之一。PCOS的重要表現(xiàn)即是高雄激素血癥。目前研究發(fā)現(xiàn),作為一種生殖系統(tǒng)疾病和激素相關(guān)性疾病,有理由懷疑PCOS也可能是某些相關(guān)基因的甲基化異常引起的。PCOS至今病因尚不明確,推測可能與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。PCOS有家族聚集現(xiàn)象,推測其為一種多基因病,遺傳方式可能為常染色體顯性也有稱為X連鎖的顯性遺傳;有證據(jù)表明,雌性胚胎發(fā)育時期給予高雄激素,導(dǎo)致成年后有高雄激素/