大鼠前庭神經(jīng)傳遞的神經(jīng)通路

大鼠前庭神經(jīng)傳遞的神經(jīng)通路

現(xiàn)在，異常的前庭感染信號是運(yùn)動(dòng)疾病（如惡心、嘔吐和胃腸不適）的主要因素。腦干的最后區(qū)、孤束核(nucleustractussolitarius,NTS)、迷走神經(jīng)背核是運(yùn)動(dòng)病與化學(xué)藥物等誘發(fā)惡心、嘔吐的主要作用區(qū)域,稱為迷走神經(jīng)背側(cè)復(fù)合體(dorsalvagalcomplex,DVC)。Takeda等認(rèn)為前庭信號至DVC,特別是NTS,可能是通過間接投射完成的,而近年來的研究表明前庭核向NTS和迷走神經(jīng)背核的直接投射可能在前庭-內(nèi)臟調(diào)節(jié)中起重要作用,但尚未有形態(tài)學(xué)證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)擬用束路追蹤方法對前庭核向DVC的間接投射進(jìn)行研究,以期為進(jìn)一步探討異常前庭傳入引發(fā)惡心、嘔吐的神經(jīng)機(jī)制提供形態(tài)學(xué)資料。1材料和方法1.1神經(jīng)/神經(jīng)電泳健康成年雄性SD大鼠14只,體質(zhì)量200～230g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分為前庭神經(jīng)內(nèi)側(cè)核(medialvestibularnucleus,MVe)電泳泳入PHA-L及DVC電泳泳入FG實(shí)驗(yàn)組(7只),和前庭神經(jīng)下核(inferiorvestibularnucleus,SpVe)電泳泳入PHA-L及DVC電泳泳人FG實(shí)驗(yàn)組(7只)。1.2小鼠腦室鏡輔助電泳分離大鼠經(jīng)稱質(zhì)量、戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔麻醉后,固定于腦立體定位儀上。切開頂部皮膚,用棉球擦去骨膜,用顱骨鉆鉆孔,暴露腦表面,按Paxinos大鼠腦定位圖譜,在手術(shù)顯微鏡下向MVe(Bregma-11.80mm,中線旁開0.8mm,距腦表面7.4mm)或SpVe(Bregma-11.80mm,中線旁開1.5mm,距腦表面7.4mm)內(nèi)插入吸有2.5%PHA-L(10mmol/L磷酸鹽配置,pH8.0,Vector)的玻璃微電極(尖端外徑約15μm)。PHA-L溶液通過銀絲與電泳儀的正極相連,電泳儀的負(fù)極連于切開的皮膚上,通以6μA的正向間歇電流,通7s、斷7s,持續(xù)15～20min。電泳完畢取出電極后,切開項(xiàng)部皮膚,分離肌肉,去掉部分枕骨,用棉球?qū)⑿∧X蚓部上推,暴露第Ⅳ腦室底。手術(shù)顯微鏡下認(rèn)清位于菱形窩下端的最后區(qū),于最后區(qū)較大處的中線右旁開約0.1mm,向DVC內(nèi)垂直插入充有2.0%FG(生理鹽水配置,Fluorochrome公司)的玻璃微電極(尖端外徑約15μm),距腦表面深約0.2mm。FG溶液通過銀絲與電泳儀的正極相連,切開的皮膚接電泳儀的負(fù)極,同樣采用6μA的正向間歇電流,通7s、斷7s,持續(xù)10min。電泳完畢取出電極后,縫合皮膚。動(dòng)物存活1周,戊巴比妥鈉(60mg/kg)腹腔注射深度麻醉、開胸、經(jīng)升主動(dòng)脈以100ml生理鹽水沖洗血液,繼而用4%多聚甲醛(0.1mol/L磷酸緩沖液配制,pH7.4)500ml灌流固定,共1.5h。取腦,在同樣的固定液中后固定4～6h,移入含30%蔗糖的磷酸緩沖液(0.1mol/LPB,pH7.4,4℃冰箱)中至材料沉底。冰凍連續(xù)切片,片厚30μm,收集于PBS(pH7.4)中。選取一套進(jìn)行裱片、干燥,于熒光顯微鏡下觀察。1.3熒光顯微鏡觀察選取FG注射區(qū)局限于DVC的腦干連續(xù)切片進(jìn)行免疫熒光反應(yīng)。步驟如下:(1)2%的正常山羊血清封閉過夜;(2)PHA-L抗體(Vector公司)1:500(含0.5%Triton-X-100,2%正常山羊血清),4℃孵育48h;(3)生物素結(jié)合的羊抗兔IgG(北京中山生物技術(shù)有限公司)1:200(含0.5%Triton-X-100,2%正常山羊血清),室溫孵育4h;(4)Avidin-FITC(北京中山生物技術(shù)有限公司)1:200(含0.5%Triton-X-100),室溫孵育2h。最后,裱片、自然干燥、熒光封片劑封片。于熒光顯微鏡下觀察、照像。熒光免疫組化的陰性對照:用0.01mol/LPBS代替PHA-L抗體稀釋液,按上述SP法進(jìn)行免疫組化染色,結(jié)果為陰性。2結(jié)果2.1注射區(qū)2.1.1注射區(qū)局限注射區(qū)局限于MVe者3只(R3,R5,R6);注射區(qū)局限于SpVe者4只(R7,R9,R12,R13);注射區(qū)位于背側(cè)巨細(xì)胞旁核、孤束核或未見任何標(biāo)記者4只;在手術(shù)過程中死亡3只。2.1.2fg注射區(qū)注射區(qū)局限于DVC者6只(R1,R3,R6,R7,R11,R12);注射區(qū)中心位于尾段孤束核者1只(R5);舌下神經(jīng)核者4只。2.2標(biāo)記纖維與終末的關(guān)系將PHA-L電泳入SpVe(圖1)后,在腦橋和延髓內(nèi)順行標(biāo)記纖維與終末的分布有如下規(guī)律:(1)標(biāo)記纖維和終末較多、為同側(cè)優(yōu)勢的是前庭核群、舌下神經(jīng)前置核、巨細(xì)胞網(wǎng)狀核、背側(cè)巨細(xì)胞旁核、下橄欖內(nèi)側(cè)副核C亞核和小細(xì)胞網(wǎng)狀核;標(biāo)記纖維和終末較少、也為同側(cè)優(yōu)勢的是藍(lán)斑核、尾段外側(cè)臂旁核、KF核、A5區(qū)。孤束核內(nèi)亦見少量的標(biāo)記纖維,但終扣或曲張?bào)w極少見。(2)標(biāo)記纖維和終末較多,分布為對側(cè)優(yōu)勢的是延髓腹外側(cè)區(qū)(ventrolateralmedulla,VLM)、外側(cè)巨細(xì)胞旁核(Lateralparagigantocellularnucleus,LPGi)、尾段疑核、巨細(xì)胞網(wǎng)狀核a部、巨細(xì)胞網(wǎng)狀核腹側(cè)部和三叉神經(jīng)感覺核。在中縫大核及中縫蒼白核內(nèi)也有少量的標(biāo)記纖維。將PHA-L電泳入MVe,順行標(biāo)記纖維和終末在腦橋、延髓的分布與泳入SpVe者基本相似,主要區(qū)別是在ILPGi和VLM內(nèi)的標(biāo)記纖維和終末較少。2.3逆標(biāo)細(xì)胞同側(cè)優(yōu)勢將FG注射于DCV(圖2),逆行標(biāo)記細(xì)胞主要分布如下:(1)逆標(biāo)細(xì)胞密集、為同側(cè)優(yōu)勢的是孤束核、LPGi、VLM、小細(xì)胞網(wǎng)狀核、巨細(xì)胞網(wǎng)狀核和KF核。(2)逆標(biāo)細(xì)胞較稀疏、也為同側(cè)優(yōu)勢的是尾段外側(cè)臂旁核、藍(lán)斑核、三叉神經(jīng)脊核背內(nèi)側(cè)部、三叉神經(jīng)感覺主核。(3)前庭核群內(nèi)僅有零星分散的標(biāo)記細(xì)胞。2.4纖維根標(biāo)記與逆標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)的重疊區(qū)域PHA-L順行標(biāo)記纖維核終末與FG逆行標(biāo)記細(xì)胞的重疊區(qū)集中在VLM(圖3,4)和LPGi(圖5,6)。3自致ldvi本研究結(jié)果表明SpVe和MVe向VLM、LPGi、疑核、臂旁核、中縫大核和中縫蒼白核等參與內(nèi)臟活動(dòng)調(diào)節(jié)的核團(tuán)均有較多投射,而向NTS和迷走神經(jīng)背核投射的纖維很少且缺乏終扣樣結(jié)構(gòu),推測這些少量的投射可能是過路纖維。Takeda等認(rèn)為前庭核到DVC的神經(jīng)通路是前庭核→中腦腹側(cè)被蓋→海馬→下丘腦結(jié)節(jié)乳頭核→DVC。這一假設(shè)的間接通路并沒有連續(xù)的、在光鏡和電鏡水平上進(jìn)行研究的形態(tài)學(xué)證據(jù)。本研究將順行追蹤劑PHA-L注入SpVe或MVe,將逆行追蹤劑FG注入DVC,發(fā)現(xiàn)只有在延髓的LPGi和VLM有順行標(biāo)記纖維與逆行標(biāo)記細(xì)胞的重疊,提示這兩個(gè)區(qū)域是最有可能中轉(zhuǎn)前庭信號到DVC的部位。本室的研究還發(fā)現(xiàn),用偏離垂直軸旋轉(zhuǎn)刺激前庭,LP-Gi、VLM和NTS內(nèi)均有大量的FOS陽性細(xì)胞,說明前庭信號確實(shí)能激活LPGi、VLM和NTS神經(jīng)元。近年來的研究發(fā)現(xiàn),LPGi和VLM還匯聚了迷走神經(jīng)、蝸神經(jīng)等多種感覺信號,并參與了軀體、心血管和呼吸等多種功能的調(diào)節(jié)。所以,LPGi和VLM是將軀體、內(nèi)臟多種傳入信號進(jìn)行綜合、分析,而后調(diào)節(jié)軀體和內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)的重要的信息整合中樞。形態(tài)學(xué)的研究證實(shí),LPGi向小腦內(nèi)側(cè)核和下丘腦存在并行的投射,向藍(lán)斑核也有大量的投射[],而異常的前庭信號對藍(lán)斑核去甲腎上腺素能系統(tǒng)的抑制和對下丘腦組胺系統(tǒng)的興奮可能是產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)病的主要原因。所以LPGi和VLM,特別是LPGi可能在將前庭信號與其他感受器傳入信號進(jìn)行整合、調(diào)節(jié)軀體和內(nèi)臟活動(dòng)的同時(shí),通過到DVC、藍(lán)斑核、下丘腦等部位