2023學(xué)年完整公開課版基因工程

1.1DNA重組技術(shù)的基本工具這樣的組合，如果用傳統(tǒng)的育種方法能否實現(xiàn)？基因工程：突破了生殖隔離，實現(xiàn)不同種生物間的基因重組2．基因工程的原理和理論基礎(chǔ)(1)原理：基因重組。(2)理論及技術(shù)基礎(chǔ)：1、拼接：不同生物DNA的基本組成單位相同，都是4種脫氧核苷酸；空間結(jié)構(gòu)相同，都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)。2、表達：生物界共用一套遺傳密碼，相同的遺傳信息在不同生物體內(nèi)表達出相同的蛋白質(zhì)。3、限制酶和DNA連接酶、質(zhì)粒等載體和逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)，則直接促使了基因工程的誕生。4、1973年，美國科學(xué)家科恩等將兩種不同來源的DNA分子進行體外重組，并首次實現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達，創(chuàng)立了定向改造生物性狀的新技術(shù)——基因工程。一、基因工程的概念

基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。該技術(shù)是在生物體外，通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細胞內(nèi)進行無性繁殖，使重組基因在受體細胞內(nèi)表達，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物?；蚬こ痰膭e名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的基因產(chǎn)物剪切→拼接→導(dǎo)入→表達理論基礎(chǔ)DNA是遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的確立遺傳信息傳遞方式(中心法則)的認定技術(shù)保障基因工程工具的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA連接酶基因載體(如質(zhì)粒)二、基因工程的誕生提取抗蟲基因棉花細胞蘇云金芽孢桿菌(有抗蟲特征)

普通棉花(無抗蟲特征)與運載體DNA拼接，導(dǎo)入(含抗蟲基因)

棉花植株(有抗蟲特征)基因工程培育抗蟲棉的簡要過程如何將蘇云金芽孢桿菌細胞內(nèi)的抗蟲基因從它的DNA分子中切割下來？如何將切下來的抗蟲基因與運載體DNA連接起來？如何將重組的DNA運送到棉花細胞？需要切割DNA的工具（分子手術(shù)刀）需要連接DNA片斷的工具

（分子縫合針）需要基因轉(zhuǎn)移的工具（分子運輸車）

——限制酶——DNA連接酶——基因運載體工具酶思考1、限制性核酸內(nèi)切酶（簡稱限制酶）能夠識別和切割DNA分子內(nèi)一小段特殊核苷酸序列的酶。含義：主要從原核生物中分離得到來源：磷酸與脫氧核糖之間的磷酸二酯鍵

作用部位：有特異性。即一種限制酶只能識別一種特定核苷酸序列，并在特定的切點上切割DNA分子。作用特點：產(chǎn)生黏性末端或平末端

作用結(jié)果：三、基因工程的基本工具EcoRIAAGTTCCTTAAGCTTAAGGAATTC識別GAATTC序列，并在G和A之間切開限制酶在切斷DNA時，可在切口處帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間堿基正好互補配對，因此稱這些片斷為黏性末端。AATTGCCTTAAG3’5’3’3’5’5’5’3’AATTGCCTTAAG要想獲得某個特定性狀的基因必須用限制性核酸內(nèi)切酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性末端？切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？會產(chǎn)生相同的黏性末端。思考CGGCCGTATAATATGCGCGCTAATCGTATAATATGCTATAEcoRIEcoRICGGCCGTTAAAATTGCGCGCTAATCGTTAAAATTGCTATACGGCCGTTAAAATTGCTATA2、DNA連接酶兩條鏈的骨架部分，形成磷酸二酯鍵

連接部位：具有相同黏性末端的兩個DNA片段連接起來，形成重組DNA分子。結(jié)果：CGGCCGTTAAAATTGCTATA三、基因工程的基本工具可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶類型：CGGCCGTTAAAATTGCTATACCCGGGGGGCCC

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低。T4DNA連接酶限制酶具有特異性，

DNA連接酶也有特異性嗎？

用DNA連接酶連接兩個相同的黏性未端要形成幾個磷酸二酯鍵？2個

用限制酶切一個特定基因要切斷幾個磷酸二酯鍵？4個外源基因（如抗蟲基因）怎樣才能運送到受體細胞（如棉花細胞）？需要“分子運輸車”——基因進入受體細胞的載體思考3、基因載體（運載體）

質(zhì)粒（最常用）、噬菌體和某些動植物病毒種類：三、基因工程的基本工具化學(xué)本質(zhì)：DNA作用：作為運載工具，將外源基因送入受體細胞。質(zhì)粒的特點：是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于細菌擬核DNA分子外并能自我復(fù)制的小型雙鏈環(huán)狀DNA分子。能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制。有切割位點有標(biāo)記基因的存在，將來可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。假如外源基因?qū)胧荏w細胞后不能復(fù)制會怎樣？作為載體如果沒有限制酶切割位點將怎樣？外源基因是否進入受體細胞，你如何去察覺？如果載體對受體細胞有害將怎樣？會在細胞增殖中丟失

外源的基因不可能插入

如果載體上有遺傳標(biāo)記基因，就可通過標(biāo)記基因的表達來檢測。

將影響受體細胞新陳代謝，進而使轉(zhuǎn)入的外源基因也可能無法表達。思考3、基因載體（運載體）

作為運載工具，將外源基因送入受體細胞。作用：條件：⑴能在宿主細胞內(nèi)自我復(fù)制并穩(wěn)定地保存⑵有一個或多個限制酶切點，可使外源基因插入其中⑶具有某些遺傳標(biāo)記基因，以便進行篩選⑷對受體細胞無害

質(zhì)粒（最常用）、噬菌體和某些動植物病毒種類：三、基因工程的基本工具化學(xué)本質(zhì)：DNA小結(jié)：“分子縫合針”——DNA連接酶1、作用：把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來。2、作用原理：催化磷酸二酯鍵形成類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點差別3、DNA連接酶與DNA聚合酶的比較DNA連接酶DNA聚合酶相同點催化兩個脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵不同點模板不需要模板需要DNA的一條鏈為模板作用對象游離的DNA片段單個的脫氧核苷酸作用結(jié)果形成重組DNA分子形成DNA的一條鏈用途基因工程DNA復(fù)制4、限制酶與DNA解旋酶的比較(1)相同點：都作用于DNA分子中的化學(xué)鍵。(2)不同點①作用部位不同：限制酶作用于磷酸與脫氧核糖之間的磷酸二酯鍵，DNA解旋酶作用于兩個堿基之間的氫鍵。②作用結(jié)果不同：限制酶在DNA分子特定部位切割DNA；DNA解旋酶是把雙鏈DNA分子間氫鍵打開使雙鏈DNA成為兩個互補的單鏈DNA分子。5、DNA連接酶與限制酶的比較(1)區(qū)別作用應(yīng)用限制酶使特定部位的磷酸二酯鍵斷裂用于提取目的基因和切割載體DNA連接酶在DNA片段之間重新形成磷酸二酯鍵將載體與外源基因組成一個重組DNA分子(2)兩者的關(guān)系可表示為：【特別提醒】

由于核苷酸分子間的氫鍵是分子間作用力，其斷裂與重新形成均與限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶無關(guān)。幾種酶的比較：1、科學(xué)家們經(jīng)過多年努力，創(chuàng)立了一種新興生物技術(shù)——基因工程，實施該工程的最終目的是（）A.定向提取生物體的DNA分子B.定向地對DNA分子進行“剪切”C.在生物體外對DNA分子進行改造D.定向地改造生物的遺傳性狀D2、以下說法正確的是（）A.所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列B.質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體C.載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接D.基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來E、DNA連接酶使黏性末端的堿基之間形成氫鍵C3、人們常選用的細菌質(zhì)粒分子往往帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因的主要作用是（）A.提高受體細胞在自然環(huán)境中的耐藥性B.有利于對目的基因是否導(dǎo)入受體細胞進行檢測C.增加質(zhì)粒分子的分子量D.便于與外源基因連接B4、下列哪項不是基因工程中經(jīng)常使用的用來運載目的基因的載體（）A.細菌質(zhì)粒B.噬菌體C.動植物病毒D.細菌核區(qū)的DNAD5、在基因工程中，切割運載體和含有目的基因的DNA片段，需使用（）A.同種限制酶B.兩種限制酶C.同種連接酶D.兩種連接酶A6、下列有關(guān)基因工程和限制性核酸內(nèi)切酶的描述，錯誤的是(

)A．一種限制性核酸內(nèi)切酶只能識別一種特定的脫氧核苷酸序列B．限制性核酸內(nèi)切酶的活性受溫度的影響C．限制性核酸內(nèi)切酶能識別和切割RNAD．限制性核酸內(nèi)切酶可從原核生物中提取C1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的獲取1、目的基因：主要指的是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。2、獲取方法：（1）自然界直接分離獲取（2）人工方法（1）從基因文庫中獲取目的基因（2）利用PCR技術(shù)擴增目的基因（3）通過DNA合成儀用人工化學(xué)方法直接合成一、目的基因的獲?。?）從基因文庫中獲取目的基因：（2）利用PCR技術(shù)擴增目的基因（3）人工合成法基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含一種生物的部分基因，如：cDNA文庫1、基因文庫

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。（2）部分基因文庫（cDNA文庫）（1）基因組文庫（1）構(gòu)建基因組文庫直接分離法--鳥槍法

用某種生物發(fā)育的某個時期的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生多種互補DNA（也叫做cDNA）片段，與載體連接后儲存在一個受體菌群中，這個受體菌群就是這種生物的cDNA文庫（一種部分基因文庫）。基因組文庫與cDNA文庫有什么區(qū)別呢？（2）部分基因文庫（cDNA文庫）P10基因的結(jié)構(gòu)原核真核1.原核基因編碼區(qū)(連續(xù))非編碼區(qū)2.真核基因編碼區(qū)外顯子內(nèi)含子間隔，不連續(xù)非編碼區(qū)非編碼序列原核真核1.原核基因編碼區(qū)(連續(xù))非編碼區(qū)2.真核基因編碼區(qū)外顯子內(nèi)含子間隔，不連續(xù)非編碼區(qū)非編碼序列啟動子課本P11外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄前體mRNA加工修飾成熟mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄a、高溫變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成

。b、低溫復(fù)性25℃-65℃：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部______。c、中溫延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的

。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因DNA雙鏈復(fù)制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸（原料）、DNA的兩條鏈為模板熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）、一對引物、溫度控制等原理：前提：條件：PCR全稱為聚合酶鏈式反應(yīng)，是一項在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因擴增方式：以指數(shù)方式（2n）擴增目的基因的mRNA逆轉(zhuǎn)錄單鏈DNA合成雙鏈DNA（目的基因）蛋白質(zhì)氨基酸序列推測mRNA的核苷酸序列推測結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列化學(xué)合成目的基因3、人工合成法（針對較小、已知核苷酸序列較小的基因）：（1）逆轉(zhuǎn)錄法（2）根據(jù)已知氨基酸序列直接合成DNA一、目的基因的獲取1、自然界直接分離獲取2、人工方法（1）從基因文庫中獲取目的基因（2）利用PCR技術(shù)擴增目的基因（3）通過DNA合成儀用人工化學(xué)方法直接合成基因工程的基本操作步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建（基因工程的核心）1、運載體的條件是什么？

⑴復(fù)制原點⑵限制酶切點

⑶標(biāo)記基因⑷無害

復(fù)制原點

+

啟動子

+

目的基因

+

終止子

+

標(biāo)記基因2、表達載體（重組DNA）的組成是什么？

它們各自的作用是什么?2、操作表達載體（重組DNA）的構(gòu)建過程：

運載體

+目的基因??目的基因自身的環(huán)化?運載體自身的環(huán)化?CGGCCGTATAATATGCGCGCTAATCGTATAATATGCTATAEcoRIEcoRICGGCCGTTAAAATTGCGCGCTAATCGTTAAAATTGCTATACGGCCGTTAAAATTGCTATAGAATTC······GACGTCTGCTTAAG······CTGCAGACG···CTGCAAATTC···G酶I酶Ⅱ用不同的限制酶切割目的基因目的基因CTTAAGACGTGCGAACTTGAACTT······GACGTCCTGCAG酶Ⅰ酶Ⅱ載體用不同的限制酶切割G···CTGCAAATTC···GCTTAAGACGTGC①②③④目的基因載體

①和③、②和④應(yīng)該符合什么條件？目的基因基因工程的基本操作步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法1、下圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關(guān)敘述，正確的是A.②的構(gòu)建需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA聚合酶參與B.③侵染植物細胞后，重組Ti質(zhì)粒整合到④的染色體上C.④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現(xiàn)出抗蟲性狀D.⑤只要表現(xiàn)出抗蟲性狀就表明植株發(fā)生了可遺傳變異思考：利用基因工程合成具有生物活性的基因產(chǎn)物（如：胰島素等），則應(yīng)選擇下列哪個作為受體細胞(

)A、病毒B、哺乳動物成熟紅細胞C、大腸桿菌D、酵母菌

受體細胞常用植物受精卵或體細胞(經(jīng)組織培養(yǎng))、動物受精卵(一般不用體細胞)、微生物細胞等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰島素則必須用真核生物,如利用酵母菌(需內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工、分泌);一般不用支原體,原因是它營寄生生活;一定不能用哺乳動物成熟的紅細胞,原因是它無細胞核,不能合成蛋白質(zhì)?；蚬こ痰幕静僮鞑襟E1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定4、目的基因的檢測與鑒定目的基因檢測：DNA分子雜交技術(shù)轉(zhuǎn)錄檢測：DNA—RNA分子雜交技術(shù)翻譯檢測：抗原—抗體雜交技術(shù)個體性狀水平檢測：個體抗性接種實驗分子雜交技術(shù)：

1、DNA探針:

含目的基因的DNA片段

2、同位素標(biāo)記法：（1）光合作用中氧氣的來源，碳元素的循環(huán)（2）用H標(biāo)記氨基酸，探究分泌蛋白的合成和運輸及生物膜的轉(zhuǎn)換（3）用P和S分別標(biāo)記噬菌體的DNA和蛋白質(zhì)，探究DNA是遺傳物質(zhì)（4）用N標(biāo)記DNA分子，