血友病af基因內(nèi)含子倒位pcr檢測(cè)法的建立及初步應(yīng)用

血友病af基因內(nèi)含子倒位pcr檢測(cè)法的建立及初步應(yīng)用

血友?。╤）是大多數(shù)臨床和隱性遺傳疾病之一，呈x光刻化。由于FⅧ基因缺陷,患者常自發(fā)性或外傷后出血不止,目前尚缺乏有效的根治措施。因此,對(duì)HA患者及其家系成員做出準(zhǔn)確的基因診斷、攜帶者篩查,可有效阻斷致病基因的進(jìn)一步傳遞,實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育,對(duì)社會(huì)及家庭具有重要意義。HAFⅧ基因定位于Xq28,含26個(gè)外顯子及25個(gè)內(nèi)含子,突變類型復(fù)雜,表現(xiàn)為點(diǎn)突變、插入、缺失、倒位、重排等類型且呈高度異質(zhì)性。資料表明,內(nèi)含子22倒位約占重型血友病患者的45%。近年來,國內(nèi)外學(xué)者多運(yùn)用長鏈PCR(Longdistance-PCR,LD-PCR)對(duì)HA家系中內(nèi)含子22倒位進(jìn)行基因診斷的初步篩查。但LD-PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求較高,實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用有一定困難。亦有文獻(xiàn)報(bào)道,該法對(duì)羊水的擴(kuò)增未曾取得滿意效果。鑒于此,本研究擬建立一種準(zhǔn)確、快速的倒位PCR檢測(cè)方法,并初步應(yīng)用于血友病A內(nèi)含子22倒位檢測(cè),旨在探討其對(duì)血友病患者、攜帶者的基因診斷及產(chǎn)前診斷的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。材料和方法1pcr檢測(cè)ha基因表達(dá)24個(gè)家系均來自于加拿大Queen′sUniversityRichardson實(shí)驗(yàn)室DavidLillicrap教授研究組及加拿大血友病診斷中心,標(biāo)本收集時(shí)間為2004年2月～2006年6月,每個(gè)家系至少有1例先證者。按國際HA診斷標(biāo)準(zhǔn),所有先證者均有詳細(xì)的HA臨床診斷證明及治療追蹤調(diào)查記錄。所有參加HA基因診斷患者均經(jīng)研究機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并征得所有家系成員同意并簽署診斷知情同意書。外周血采用DNA提取試劑盒,分光光度計(jì)測(cè)定DNA純度及濃度后分裝、-80℃保存?zhèn)溆谩?例22內(nèi)含子倒位攜帶者在孕18周抽取羊水,常規(guī)酚氯法提取羊水細(xì)胞DNA,濃度測(cè)定及儲(chǔ)存同上。2基因外引物及內(nèi)含子的篩選內(nèi)含子22、內(nèi)含子1引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn),均由Invitrogen公司合成。內(nèi)含子22引物序列:上游共用引物IU:5′-CCTTTCA-ACTCCATCTCCAT-3′(Accessionnumber:BX-842559,nt:35744-35763),下游引物ID:5′-ACATACGGTTTAGTCACAAGT-3′(Accessionnumber:BX842559,nt:14622-14602),基因外的下游引物ED:5′-TCCAGTCACTTAGGCTCAG-3′(Accessionnumber:BX682237,nt:15364-15347)。內(nèi)含子1引物序列:INT19F:5′-GTTGTTGGG-AATGGTTACGG-3′,INT12F:5′-GGCAGGG-ATCTTGTTGGTAAA-3′,INT12R:5′-TGGG-TGATATAAGCTGCTGAGCTA-3′。SRY-F:5′-GATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTG-3′,SRY-R:5′-CTGTAGCGGTCCCGTTGC-TGCGGTG-3′。Taq酶、BclⅠ酶購自Promega公司、T4Ligase購自Invitrogen公司。BiometraTProfessionalThermocyclerPCR儀,Bio-Rad凝膠電泳裝置、Bio-RadGelDoc2000凝膠成像系統(tǒng),其他均為分子診斷實(shí)驗(yàn)室常規(guī)設(shè)備。3f基因22位倒位檢測(cè)、隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)和1位內(nèi)含子的倒位檢測(cè)3.1酶切f基因片段的擴(kuò)增和克隆的表達(dá)在FⅧ基因內(nèi)含子22中有2個(gè)基因FⅧA和FⅧB,FⅧA轉(zhuǎn)錄方向與FⅧ相反,FⅧB與FⅧ相同。X染色體遠(yuǎn)端另有2個(gè)FⅧA同源基因。FⅧA可與2個(gè)同源基因之一發(fā)生同源重組,從而使FⅧA基因從外顯子1～22倒位至X染色體長臂遠(yuǎn)端,而外顯子23～26仍處于原位。結(jié)果見圖1。研究中應(yīng)用BclⅠ限制酶酶切FⅧ基因片段,酶切片段包含上述同源序列,酶切DNA產(chǎn)物用T4連接酶自連接成環(huán)狀,在環(huán)狀DNA連接點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。若為野生型,連接點(diǎn)上下游引物IU、ID間序列經(jīng)PCR擴(kuò)增可得到487bp片段。若為內(nèi)含子22倒位,連接點(diǎn)上下游引物IU、ED間序列經(jīng)PCR擴(kuò)增可得到559bp片段。若為攜帶者,則可同時(shí)擴(kuò)增出487、559bp兩條片段。3.2pcr檢測(cè)取上述基因組DNA1～2μg,50μl酶切反應(yīng)體系中加入BclⅠ限制性內(nèi)切酶10～20U(10U/μgDNA),補(bǔ)齊三蒸水,于50℃恒溫條件下反應(yīng)4～6h或過夜充分消化。酶切后產(chǎn)物經(jīng)酚-氯仿(1∶1)抽取2次,繼以氯仿-異戊醇(24∶1)抽取1次,以3mol/L醋酸鈉及2倍體積預(yù)冷乙醇沉淀后,溶解于50μl三蒸水中。酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接成環(huán)狀,連接反應(yīng)體系600μl:其中含5×緩沖液120μl,上述提取的DNA50μl,T4DNA連接酶3U,雙蒸水補(bǔ)齊,在16℃恒溫條件下反應(yīng)20h。連接產(chǎn)物經(jīng)上述酚-氯仿-異戊醇抽取,醋酸鈉及乙醇沉淀后溶解于20μl三蒸水。25μl反應(yīng)體系中包括10×PCRBuffer2.5μl、2.5mmol/LdNTP2μl、MgCl20.75μl、1U/1D/ED引物各0.75μl、連接產(chǎn)物6μl、Taq酶0.1μl、ddH2O11.4μl。PCR反應(yīng)條件:94℃2min,繼之94℃30s、55℃60s、72℃90s,30個(gè)循環(huán),72℃10min,陽性擴(kuò)增片段為559bp,正常對(duì)照片段僅為487bp,攜帶者為上述2條帶。1.0%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,判讀結(jié)果。對(duì)于檢測(cè)陽性者,抽取患者母親外周血,提取DNA后按照上述方法對(duì)內(nèi)含子22倒位進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)患者要求,對(duì)其中1例內(nèi)含子22倒位攜帶者在孕18周抽取羊水,常規(guī)酚氯法提取羊水細(xì)胞DNA,按照上述方法對(duì)內(nèi)含子22倒位進(jìn)行檢測(cè)。3.3f/2rt-pcr反應(yīng)取基因組DNA0.5μl(200ng),在25μl反應(yīng)體系中依次加入10×PCR緩沖液2.5μl、2.5mmol/LdNTP2.5μl、MgCl20.75μl、2F/2R/9F各0.5μl、Taq酶0.25μl、ddH2O15.75μl。反應(yīng)條件:95℃5min,繼之95℃30s、65℃30s、72℃2min,共30個(gè)循環(huán)。陽性擴(kuò)增片段為2kb,正常對(duì)照為1.5kb,攜帶者為2、1.5kb兩條帶。4紫外溫升電泳配制1.5%瓊脂糖凝膠,PCR產(chǎn)物5μl加入6×上樣緩沖液1μl混合,在恒壓100V電泳20～30min,EB染色后,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)于紫外燈下觀察電泳結(jié)果,見圖2。5sry基因rt-pcr反應(yīng)對(duì)其中1例內(nèi)含子22倒位攜帶者母親在孕18周做羊水產(chǎn)前診斷,羊水DNA擴(kuò)增SRY基因,反應(yīng)體系同上,反應(yīng)條件:94℃3min,繼之94℃30s、58℃30s、72℃1min,共30個(gè)循環(huán),最后72℃10min。電泳后陽性擴(kuò)增片段為336bp。結(jié)果1患者臨床診斷結(jié)果運(yùn)用倒位PCR技術(shù)對(duì)24個(gè)家系24個(gè)先證者進(jìn)行內(nèi)含子22倒位檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)7例患者為陽性,即電泳結(jié)果僅出現(xiàn)559bp條帶。進(jìn)一步核對(duì)資料發(fā)現(xiàn),該7例患者經(jīng)臨床診斷,均為重型HA,進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)7例HA患者母親中有6例亦為22倒位攜帶者,提示該6例先證者22內(nèi)含子倒位系由其母親傳遞。本研究內(nèi)含子22倒位檢出率為29.17%,接近臨床重型HA內(nèi)含子倒位25%的發(fā)病率。全部24個(gè)家系先證者檢測(cè)未見內(nèi)含子1倒位情況發(fā)生,可能與待檢樣本例數(shù)過少有關(guān)。21胎兒染色體核型分析結(jié)果上述1例攜帶者母親在孕18周要求做羊水產(chǎn)前診斷,經(jīng)SRY基因性別診斷(圖片未提供)及羊水細(xì)胞遺傳學(xué)染色體核型分析,均證實(shí)為女性胎兒。同時(shí)對(duì)羊水細(xì)胞DNA進(jìn)行上述內(nèi)含子22倒位檢測(cè),電泳結(jié)果僅出現(xiàn)487bp的條帶,說明胎兒不存在內(nèi)含子22倒位,同時(shí)進(jìn)行內(nèi)含子1倒位檢測(cè),結(jié)果陰性。診斷為正常胎兒,產(chǎn)后隨訪和產(chǎn)前診斷結(jié)果一致。haf基因檢測(cè)血友病A系FⅧ基因缺陷導(dǎo)致的一種遺傳性出血性疾病。FⅧ基因全長186kb,定位于Xq28,包括26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子,編碼長約9kbmRNA。近年來研究表明,約有75%～80%血友病A由基因突變引起,目前已逾900多種突變被報(bào)道,表現(xiàn)為點(diǎn)突變、插入、缺失、重排等,大多以點(diǎn)突變?yōu)橹?且?guī)缀醣椴糉Ⅷ基因所有編碼區(qū),異常復(fù)雜,呈高度異質(zhì)性。此外,有資料表明,FⅧ基因內(nèi)含子22倒位約占重型血友病患者的45%,內(nèi)含子1倒位約占重型血友病患者3%～5%。因此,目前國際上多數(shù)學(xué)者對(duì)血友病患者、攜帶者進(jìn)行基因診斷或產(chǎn)前診斷前首先進(jìn)行內(nèi)含子22、內(nèi)含子/倒位檢測(cè),若家系成員檢測(cè)結(jié)果陽性即可直接診斷為HA患者或致病基因的攜帶者。內(nèi)含子22、1倒位檢測(cè)屬直接基因診斷,對(duì)一些HA家系成員不全或由于新生突變致病的患者尤為重要。既往對(duì)內(nèi)含子22倒位檢測(cè),國際上多采用Southern印跡法,盡管此法可以鑒別遠(yuǎn)端及近端倒位,但操作過程復(fù)雜、DNA用量大、檢測(cè)周期長,且需使用放射性同位素標(biāo)記探針,因此很難用于臨床常規(guī)檢測(cè)。隨后,國內(nèi)劉敬忠等報(bào)道運(yùn)用長鏈PCR(LD-PCR)技術(shù),快速檢測(cè)FⅧ基因內(nèi)含子22倒位,并能檢出攜帶者,進(jìn)行產(chǎn)前診斷。LD-PCR擴(kuò)增片段長度達(dá)12kb,其中包含3.5kbGC島,對(duì)反應(yīng)體系及酶要求較高,實(shí)驗(yàn)操作難度相對(duì)較大,對(duì)于普通分子實(shí)驗(yàn)室推廣運(yùn)用有一定的困難。此外,也有文獻(xiàn)報(bào)道,LD-PCR對(duì)HA患者及攜帶者檢測(cè)適用,但對(duì)于羊水細(xì)胞DNA擴(kuò)增效果未曾取得滿意效果。丁培芳等報(bào)道,可通過B超引導(dǎo)下抽取胎兒臍帶血進(jìn)行LD-PCR,但臍血穿刺對(duì)胎兒具有一定的創(chuàng)傷性,不易用于常規(guī)產(chǎn)前診斷。2005年Rossetti等在國際上首次報(bào)道運(yùn)用I-PCR技術(shù)檢測(cè)HAFⅧ基因內(nèi)含子22倒位,該方法采用的是普通分子實(shí)驗(yàn)室常規(guī)技術(shù),簡單易行。主要由3步組成,即酶切、T4連接酶連接及PCR擴(kuò)增。與LD-PCR技術(shù)相比,I-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段較短,為559bp和487bp,易于實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果判讀,大大降低了LD-PCR的擴(kuò)增難度,但缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)步驟較LD-PCR略繁瑣,檢測(cè)時(shí)間相對(duì)延長。我們運(yùn)用該技術(shù),成功地在24個(gè)HA家系中檢測(cè)出7例患者內(nèi)含子22倒位,陽性檢出率為29.17%,可診斷率為100%,且資料顯示該7例患者均來自重型血友病家系,與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。進(jìn)一步運(yùn)用該法對(duì)上述內(nèi)含子22倒位患者的母親進(jìn)行攜帶者檢測(cè),結(jié)果提示7例患者母親中有6例系內(nèi)含子22倒位,直接明確了診斷,同時(shí)省卻了后續(xù)較繁瑣的點(diǎn)突變篩查或家系連鎖分析。對(duì)于其中1例攜帶者母親,經(jīng)患者要求,在其懷孕18周左右抽取羊水,同時(shí)行SRY基因性別診斷和內(nèi)含子22倒位篩查,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與傳統(tǒng)羊水細(xì)胞遺傳染色體核型分析對(duì)照,結(jié)果顯示,待診斷胎兒為女性,內(nèi)