pcsk9sirna對氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)hp-1源性巨噬細(xì)胞凋亡的影響

pcsk9sirna對氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)hp-1源性巨噬細(xì)胞凋亡的影響

前蛋白轉(zhuǎn)化酶蛋白9（curon，kexin，pcsk9）的基因編碼功能主要是由current大豆蛋白1（na2c-1）引起的。該基因?qū)儆诘鞍踪|(zhì)轉(zhuǎn)移酶序列。目前，pcsk9與narc-1的研究表明，其生物學(xué)功能主要包括三種：第一，調(diào)節(jié)肝表面的低密度血脂受體（ldll），這在血液中的脂質(zhì)代謝中起著重要作用。第二，它可以影響神經(jīng)系統(tǒng)的分化以及神經(jīng)元的去世。最近，一些研究人員提出，pcsk9不僅可以通過肝細(xì)胞ldll的調(diào)節(jié)來參與動脈樣本硬化（as）的發(fā)生，而且還可以通過影響mcclovac細(xì)胞的代謝來促進as的發(fā)展。在本研究中，以thol-1為研究對象，觀察pcsk9的外觀變化。為了適應(yīng)oxldl，使用racema技術(shù)（鈉干擾，鈉i）穩(wěn)定pcsk9基因，影響oxldl誘導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡，為pcsk9作為實驗對象，為as出現(xiàn)和發(fā)展提供實驗依據(jù)。這對澄清as的發(fā)生機制非常重要，對預(yù)防和控制as的發(fā)展提供了新的目標(biāo)。1材料和方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化成細(xì)胞的誘導(dǎo)THP-1源性細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞中心,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).培養(yǎng)基中加HEPES10mmol/L,在每次實驗前用160nmol/L佛波酯(phorbol12-myristste13-acetate,PMA)孵育24h,使其誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞.1.2低密度膠原蛋白的制備健康人血漿購自衡陽市中心血站.用超速離心法制備低密度脂蛋白,用10μmol/LCuSO4氧化修飾成氧化低密度脂蛋白,4℃保存.0.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定氧化與否.1.3g/loxoldl及c.5.5mdl處理THP-1源性巨噬細(xì)胞接種于6孔板內(nèi),在每次實驗前換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12h,實驗分組如下:a.空白對照組,無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48h;b.25mg/LoxLDL處理48h;c.50mg/LoxLDL處理48h;d.75mg/LoxLDL處理48h;e.100mg/LoxLDL處理48h.Hoechst33258染色,以紫外光340nm波長激發(fā),熒光顯微鏡下觀察、攝片.在凋亡細(xì)胞中,細(xì)胞膜對Hoechst33258的攝取增高,并且由于染色體高度濃縮,Hoechst33258與之結(jié)合增強,染色呈強藍(lán)色熒光,而正常細(xì)胞只呈微弱熒光,死細(xì)胞則不被染色.1.4rt-pcr檢測相關(guān)基因表達(dá)用TRIzol試劑提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再進行PCR循環(huán)擴增.pcsk9的引物序列:上游5′ACGATGCCTGCCTCTACTCC3′,下游5′GC-CTGTGATGTCCCACTCTGT3′,擴增片段長度為205bp.內(nèi)參照采用GAPDH,引物序列:上游5′TCACCATCTTCCAGGAGCGAG3′,下游5′TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG3′,擴增片段長度為697bp.取RT-PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳,pcsk9加樣量均為10μl,內(nèi)參的加樣量為3μl,溴化乙錠染色.電泳條帶采用UVP型凝膠圖像分析系統(tǒng)做積分吸光度測定和分析,以各組的基因與內(nèi)參照基因吸光度的比值來比較待測基因的mRNA表達(dá)差異.1.5蛋白質(zhì)檢測收集細(xì)胞,經(jīng)PBS洗滌3次,加入懸浮細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,置于冰上20min后,于4℃,10000g離心10min,小心吸出上清液,用BCA法進行蛋白質(zhì)定量,取50μg蛋白質(zhì)每泳道加入等體積5×SDS凝膠加樣緩沖液,煮沸使蛋白質(zhì)變性.80V積層膠,120V分離膠,電泳分離蛋白質(zhì),80mA1h將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上.5%脫脂牛奶4℃封閉12h,加入一抗,4℃8h,TBST洗膜15min,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育2h,TBST洗膜15min,然后用Wseternblot熒光檢測試劑激發(fā)熒光,顯示于X光片,顯影、定影后進行圖像分析.1.6有效選集1.6.1sirna的純化在GenBank中查到人pcsk9mRNA序列(編號NM_174936),選擇不同位點設(shè)計了3對pcsk9siRNAs,以上序列經(jīng)序列相似性軟件比對不與任何已知基因有同源性.pcsk9siRNAs由廣州銳博生物科技有限公司合成并進行熒光標(biāo)記,pcsk9siRNA-1正義鏈:5′CCUGG-AGUUUAUUCGGAAAdTdT3′,反義鏈:3′dTdTGGACCUCAAAUAAGCCUUU5′.pcsk9siRNA-2正義鏈:5′GGCAGAGACUGAUCCACUUdTdT3′,反義鏈:3′dTdTCCGUCUCUGACUAGGUG-AA5′.pcsk9siRNA-3正義鏈:5′GGUCUG-GAAUGCAAAGUCAdTdT3′,反義鏈:3′dTdTCCAGACCUUACGUUUCAGU5′.陰性對照siRNA由該公司提供.siRNA成品為已退火的凍干粉,使用前用稀釋緩沖液將其溶解成20μmol/L的工作母液.所有siRNA均經(jīng)過變性和非變性聚丙酰胺凝膠電泳純化,去除未配對單鏈.1.6.2sirna法檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染、接種與接種細(xì)胞后細(xì)胞的生長在5nmol的siRNA中加入250μl無RNA酶水(公司配送),得到濃度為20μmol/L的siRNA母液.轉(zhuǎn)染前24h將細(xì)胞接種至6孔板.siRNA用OptiMEMⅠ稀釋,待加入細(xì)胞后,終濃度達(dá)30nmol/L、50nmol/L、80nmol/L.1.6.3fam-sirna的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染6h后,先用PBS洗滌細(xì)胞1~2次,洗脫殘留在培養(yǎng)基或細(xì)胞表面的FAM-siRNA,減少背景干擾.熒光顯微鏡觀察,成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可看到FAM綠色熒光散在分布在細(xì)胞質(zhì)中.1.6.4rt-pcr法檢測nd-pcr表達(dá)轉(zhuǎn)染不同濃度的siRNA(30nmol/L、50nmol/L、80nmol/L)24h后,提取RNA,用RT-PCR的方法檢測各實驗組pcsk9mRNA的表達(dá),從而選取最有效的siRNA濃度.設(shè)立空白對照組(blankcontrol),轉(zhuǎn)染試劑組(transfectionreagent),陰性對照組(negativecontrol),siRNA組.1.6.5sirnblot構(gòu)建細(xì)胞系統(tǒng)選定RT-PCR結(jié)果篩選出的有效的siRNA濃度,轉(zhuǎn)染三對針對不同靶點設(shè)計的siRNAs.48h后提取蛋白質(zhì),用Westernblot方法檢測各實驗組NARC-1蛋白表達(dá).從而篩選出最有效的一對siRNA.分組同前.1.7考慮到pcsk9sina對ox簽署網(wǎng)絡(luò)的影響1.7.1細(xì)胞凋亡的觀察用篩選好濃度的有效siRNA轉(zhuǎn)染THP-1源性巨噬細(xì)胞后,oxLDL處理48h,Hoechst33258染色形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡.1.7.2細(xì)胞dna的提取和測定用篩選好濃度的有效siRNA轉(zhuǎn)染THP-1源性巨噬細(xì)胞后,oxLDL處理48h,收集細(xì)胞,加PI至終濃度5mg/L,350目尼龍網(wǎng)濾膜過濾去除細(xì)胞團塊,4℃避光染色30min后,上流式細(xì)胞儀檢測(激發(fā)波長488nm,發(fā)射波長610nm)各期細(xì)胞DNA的含量.測定數(shù)據(jù)按流式細(xì)胞儀所配置的軟件進行數(shù)據(jù)處理.1.8統(tǒng)計處理所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間采用方差分析及t檢驗,由SPSS11.0統(tǒng)計軟件完成,P<0.05為差異有顯著性意義.2結(jié)果2.1thp-1細(xì)胞凋亡75mg/LoxLDL組處理THP-1源性巨噬細(xì)胞中,出現(xiàn)大量的核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的凋亡細(xì)胞.100mg/LoxLDL組處理THP-1源性巨噬細(xì)胞中,因為細(xì)胞出現(xiàn)較多死亡,細(xì)胞數(shù)目減少,凋亡細(xì)胞反而較少(圖1).2.2thp-1對小鼠細(xì)胞narc-1表達(dá)的影響THP-1源性巨噬細(xì)胞分別與0、25、50、75、100mg/LoxLDL孵育48h后,用RT-PCR方法檢測各實驗組pcsk9mRNA的水平(圖2).結(jié)果顯示:25mg/L(面積灰度比值為0.769)、50mg/L(面積灰度比值為0.946)、75mg/L(面積灰度比值為1.019),100mg/L(面積灰度比值為0.995)與0mg/L(面積灰度比值為0.752)處理組相比,各濃度處理組細(xì)胞pcsk9mRNA的表達(dá)均有所增加,以75mg/L濃度處理組增加最明顯(P<0.05).THP-1源性巨噬細(xì)胞分別與0、25、50、75mg/LoxLDL孵育48h后,用Westernblot方法檢測各實驗組細(xì)胞NARC-1蛋白表達(dá)(圖3).結(jié)果顯示,25mg/L(面積灰度比值為0.937)、50mg/L(面積灰度比值為0.951),75mg/L(面積灰度比值為1.009)、100mg/L(面積灰度比值為0.997)與0mg/L(面積灰度比值為0.934)處理組相比,各濃度處理組細(xì)胞NARC-1蛋白的表達(dá)均有所增加,以75mg/L濃度處理組增加最明顯(P<0.05).2.3sirna的轉(zhuǎn)染效率在轉(zhuǎn)染6h后用熒光顯微鏡檢測,如圖4中發(fā)綠色熒光的細(xì)胞表示siRNA已成功轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi).與同一視野下光學(xué)顯微鏡圖片對照,大致判斷有較高的轉(zhuǎn)染效率(圖4).2.4pcsk9sirna表達(dá)轉(zhuǎn)染不同濃度的siRNA24h后,提取RNA,用RT-PCR的方法檢測各組pcsk9mRNA表達(dá)(圖5,6,7).結(jié)果顯示:siRNA濃度為80nmol/L,三對siRNA均出現(xiàn)明顯的pcsk9基因沉默效應(yīng),而其中pcsk9siRNA-1與pcsk9siRNA-3在濃度為30nmol/L時pcsk9表達(dá)反而出現(xiàn)上調(diào).2.5pcsk9sirnblot檢測narc-1蛋白表達(dá)選取80nmol/L作為pcsk9siRNA實驗濃度,轉(zhuǎn)染3對pcsk9siRNAs48h后,提取蛋白質(zhì),用Westernblot方法檢測各實驗組NARC-1蛋白表達(dá)(圖8).結(jié)果顯示,與對照組相比,實驗選取的三對pcsk9siRNAs均能在蛋白質(zhì)水平抑制NARC-1蛋白的表達(dá).2.6pcsk9sina對ox鱗片血漿蛋白1的影響2.6.1細(xì)胞形態(tài)特征的檢測2.6.2thp-1的自然凋亡率和oxldl對表達(dá)的抑制率細(xì)胞經(jīng)PI染色后,用流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞可在G0/G1期前形成一亞二倍體凋亡峰.結(jié)果如圖10所示,THP-1源性巨噬細(xì)胞自然凋亡率為1.04%,經(jīng)75mg/LoxLDL處理48h后,凋亡率為19.8%,轉(zhuǎn)染pcsk9siRNA-2后用75mg/LoxLDL處理組凋亡率為4.11%.表明轉(zhuǎn)染pcsk9siRNA后可抑制oxLDL誘導(dǎo)的THP-1源性巨噬細(xì)胞的凋亡.3sirnas對b.n細(xì)胞凋亡的影響巨噬細(xì)胞在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用.巨噬細(xì)胞攝取大量脂質(zhì)成為荷脂細(xì)胞,荷脂巨噬細(xì)胞的凋亡增加脂質(zhì)的沉積,同時分泌大量炎性因子影響斑塊的穩(wěn)定性.本實驗采用oxLDL誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞凋亡,選取5個濃度梯度,誘導(dǎo)48h后,經(jīng)Hoechst33258染色熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),可以看出隨著oxLDL濃度的增加,THP-1源性巨噬細(xì)胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的凋亡細(xì)胞有增多趨勢,75mg/LoxLDL處理48h可以誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞出現(xiàn)凋亡最明顯,oxLDL濃度增加到100mg/L時,細(xì)胞出現(xiàn)較多壞死,凋亡細(xì)胞反而較少.當(dāng)前的研究表明,pcsk9主要是通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞表面低密度脂蛋白受體(LDLR)參與膽固醇代謝從而間接參與As的發(fā)生.pcsk9是否對血管壁有直接毒性作用及其作用機制目前并不清楚.課題組前期研究發(fā)現(xiàn),oxLDL在10~30mg/L時對THP-1源性巨噬細(xì)胞中pcsk9表達(dá)沒有影響,但當(dāng)oxLDL濃度達(dá)到50mg/L時pcsk9表達(dá)明顯上調(diào),提示pcsk9可能在oxLDL誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)改變中起作用.pcsk9是一種神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶,體外細(xì)胞實驗也發(fā)現(xiàn)pcsk9參與了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,pcsk9是否參與巨噬細(xì)胞的凋亡呢?本實驗從pcsk9對巨噬細(xì)胞凋亡作用入手,研究pcsk9是否是發(fā)揮對血管壁細(xì)胞的直接作用來參與動脈粥樣硬化.實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),高濃度的oxLDL可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡,75mg/L時細(xì)胞凋亡最明顯.同時,隨著oxLDL處理濃度的增加,pcsk9mRNA和NARC-1蛋白的表達(dá)均上調(diào),在75mg/L時表達(dá)最高.這些結(jié)果一定程度上提示巨噬細(xì)胞這種凋亡與pcsk9表達(dá)可能存在某種相關(guān)性.也根據(jù)此結(jié)果設(shè)定75mg/L作為本實驗后續(xù)oxLDL處理濃度.RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA所引起的序列特異性基因沉默.RNAi技術(shù)作為新興的基因阻抑方法,在功能基因組學(xué)、微生物學(xué)、基因表達(dá)調(diào)控機理研究等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用.本實驗選擇化學(xué)合成法合成siRNA,有利于應(yīng)用熒光物質(zhì)標(biāo)記siRNA,便于用熒光顯微鏡分析siRNA進入細(xì)胞過程或者在細(xì)胞中的定位.本實驗中THP-1源性巨噬細(xì)胞經(jīng)佛波酯(phorbolmyristoylacetate,PMA)誘導(dǎo)后為貼壁細(xì)胞,較之懸浮細(xì)胞具有轉(zhuǎn)染效率高的特點,實驗更具可行性,保證了后繼實驗的效果.研究已經(jīng)證實,不同位點的siRNAs具有不同的干擾效率,所以本實驗設(shè)計了多對針對pcsk9不同位點的siRNAs進行篩選,以保證干擾的有效性.實驗設(shè)定3個siRNAs濃度梯度(30、50、80nmol/L),先在mRNA水平檢測基因抑制情況,發(fā)現(xiàn)隨著濃度的提高這種沉默效應(yīng)明顯,在siRNA的終濃度為80nmol/L時出現(xiàn)明顯的沉默效應(yīng).但也發(fā)現(xiàn),有在30nmol/L時基因的表達(dá)反而出現(xiàn)了上調(diào)的情況,此種劑量效應(yīng)的缺失與siRNA所致的基因抑制效應(yīng)和某些尚不清楚的機制導(dǎo)致的基因表達(dá)活化效應(yīng)這兩者間的此消彼長有關(guān).實驗選取終濃度為80nmol/L的siRNA進一步檢測蛋白質(zhì)水平基因抑制情況,篩選出最有效的一對siRNA.在多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)染人工合成的siRNA后,基因的抑制高峰時間為48~72h,而本實驗中,24hmRNA抑制效應(yīng)就開始顯現(xiàn),48h蛋白質(zhì)抑制效應(yīng)出現(xiàn).但本實驗沒有選擇多個時間點采樣,缺少了這種抑制效應(yīng)維持時間的證據(jù).實驗結(jié)果表明,本實驗設(shè)計的siRNAs能有效抑制pcsk9基因的表達(dá).為了進一步證實pcsk9與巨噬細(xì)胞凋亡之間可能的相關(guān)性,進一步通過形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞計數(shù)評價了pcsk9基因沉默后,對巨噬細(xì)胞凋亡的影響.實驗結(jié)果表明,將能有效抑制pcsk9基因表達(dá)的siRNA轉(zhuǎn)染THP-1源性巨噬細(xì)胞后,oxLDL誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用被明顯抑制.綜上所述,我們的研究表明,較高濃度oxLDL對巨噬細(xì)胞有明顯促凋亡作用,隨著oxLDL濃度增加巨噬細(xì)胞凋亡明顯,同時pcsk9的表達(dá)也隨之變化,且趨勢相一致.進一步將pcsk9基因沉默之后,觀察這種凋亡作用是否有影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),應(yīng)用siRNA干擾pcsk9表達(dá)后對ox