脂多糖誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞系raw2647細(xì)胞活化凋亡

脂多糖誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞系raw2647細(xì)胞活化凋亡

脂肪子（lps）是革蘭氏陰性細(xì)菌傷口的主要成分，也是其起源的主要基本因素。LPS是誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞活化、成熟的主要物質(zhì),可通過刺激單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并釋放大量的一氧化氮(NO)、IL-1β以及腫瘤壞死因子-α(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)等炎癥因子參與機(jī)體急性期應(yīng)答,引起機(jī)體炎性損傷[1~5]。單核/巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)不是無限制的進(jìn)行,通過機(jī)體自我調(diào)控可以終止炎性反應(yīng),但其確切機(jī)理尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn),LPS短時(shí)間刺激可以活化小鼠巨噬細(xì)胞分泌NO及IL-1β,而過量的NO又是細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因子。因此推測(cè)作為炎性反應(yīng)的啟動(dòng)因素,LPS有可能通過誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過量的NO,而誘導(dǎo)其活化凋亡,進(jìn)而終止其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本文觀察了LPS長(zhǎng)時(shí)間刺激小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞后,對(duì)其增殖及凋亡的影響,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1.材料和方法1.1細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞來源于小鼠巨噬細(xì)胞系,由上海細(xì)胞所提供。1.2染液和試劑盒LPS購(gòu)自Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司;碘化丙啶(PI)染液購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展公司;PI-AnnexinV雙染試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司。1.3fcs、100u/ml激素的rpmi1340培養(yǎng)模式RAW264.7細(xì)胞采用含10%滅活胎牛血清(FCS)、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液,在37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng),每3d傳代1次。1.4細(xì)胞培養(yǎng)及復(fù)孔將RAW264.7細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,分別加入含終濃度為0.5、1.0及2.5μg/mlLPS的RPMI1640培養(yǎng)液,培養(yǎng)24h。以未加LPS的RAW264.7細(xì)胞作為對(duì)照。每組設(shè)3復(fù)孔。收集各孔中的細(xì)胞培養(yǎng)上清,用NO檢測(cè)試劑盒檢測(cè)上清中的NO含量,操作按說明書進(jìn)行。1.5細(xì)胞培養(yǎng)與檢測(cè)將RAW264.7細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,分別加入含1.0μg/mlLPS的RPMI1640培養(yǎng)液,分別于培養(yǎng)3d、6d后收集細(xì)胞,采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。1.6細(xì)胞周期分析將RAW264.7細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,加入含1.0μg/mlLPS的RPMI1640培養(yǎng)液,培養(yǎng)6d后,收集細(xì)胞,用冰冷PBS洗滌2次,70%冰乙醇固定過夜,加入PI染液(含100μg/mlRNA酶和0.1%Triton-100),避光反應(yīng)1h,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,Cellquest軟件分析結(jié)果。另將收集的細(xì)胞應(yīng)用PI-AnnexinV雙染試劑盒進(jìn)行細(xì)胞染色,操作按試劑盒說明書進(jìn)行,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,Cellquest軟件分析結(jié)果。1.7統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)用表示,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.結(jié)果2.1兩組促進(jìn)作用比較檢測(cè)結(jié)果表明,不同濃度的LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO的水平均具有明顯的促進(jìn)作用,且具有劑量依賴性,與對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=4.96,t2=4.89,t3=3.97,P均小于0.01),見圖1。表明LPS可促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞分泌NO。2.2細(xì)胞增殖的影響檢測(cè)結(jié)果表明,LPS刺激RAW264.7細(xì)胞3d和6d,細(xì)胞的增殖均受到抑制,并具有時(shí)間依賴性,與對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t3d=3.62,t6d=4.31,P均小于0.01),見圖2。表明LPS可抑制RAW264.7細(xì)胞增殖。2.3細(xì)胞凋亡亞峰檢測(cè)結(jié)果表明,LPS刺激RAW264.7細(xì)胞6d后,細(xì)胞周期S期的比率為50.47%,明顯高于對(duì)照組細(xì)胞的41.58%(t=2.91,P<0.05),并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡亞峰,見圖3。表明LPS可促使RAW264.7細(xì)胞周期S期發(fā)生阻滯,且誘導(dǎo)凋亡。2.4兩組胞凋亡率比較檢測(cè)結(jié)果表明,LPS刺激RAW264.7細(xì)胞6d后,細(xì)胞凋亡率為14.09%,而對(duì)照組細(xì)胞凋亡率僅為7.7%,二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.71,P﹤0.01),見圖4。表明LPS可誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡。3.lps的作用機(jī)制巨噬細(xì)胞是機(jī)體防御系統(tǒng)中重要的免疫細(xì)胞,在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。巨噬細(xì)胞通過吞噬外來異物或提呈抗原給T細(xì)胞,完成清除抗原性異物的免疫防御作用。同時(shí),巨噬細(xì)胞也是一種重要的炎癥細(xì)胞,能夠?qū)ρ装Y反應(yīng)起雙重調(diào)節(jié)作用。巨噬細(xì)胞通過分泌NO、IL-1、TNF-α等多種生物活性物質(zhì),促進(jìn)急性期應(yīng)答,加速對(duì)有害物質(zhì)的清除。但這些生物活性物質(zhì)也是重要的炎癥介質(zhì),活化的巨噬細(xì)胞如持續(xù)性釋放過量的炎癥介質(zhì),可引起機(jī)體炎性損傷。因此,機(jī)體如何通過自我調(diào)節(jié)及時(shí)終止巨噬細(xì)胞活性,具有至關(guān)重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn),不同劑量的LPS作用于RAW264.7細(xì)胞24h,均可活化巨噬細(xì)胞,顯著提高其NO的釋放水平。NO是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子,在內(nèi)毒素致機(jī)體損傷中起重要作用。LPS通過促使巨噬細(xì)胞活化并釋放過量NO等炎癥分子,進(jìn)而參與炎癥反應(yīng),但是,這種活化引起的損傷并不是無止境的。我們發(fā)現(xiàn),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),1.0μg/mlLPS作用3d時(shí),RAW264.7細(xì)胞的增殖已明顯受到抑制,6d時(shí)細(xì)胞周期被阻滯在S期,并