il-1基因多態(tài)性與侵襲性牙周炎易感性的關(guān)聯(lián)分析

il-1基因多態(tài)性與侵襲性牙周炎易感性的關(guān)聯(lián)分析

預(yù)防性牙周炎（agp）是一組臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查與慢性牙周炎（agp）顯著不同的牙齒周炎。通常發(fā)生于全身健康的年輕患者。臨床表現(xiàn)為快速附生畸形和牙槽骨損傷，容易出現(xiàn)早期牙齒的松動(dòng)和脫落，具有一定的家族聚集特征。Kornman等在1997年首次將白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1)的基因多態(tài)性引入到與牙周炎的關(guān)聯(lián)研究中來,之后國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)IL-1基因的多態(tài)性與牙周炎的關(guān)系作了大量的研究,結(jié)果不盡相同。這通常與研究的樣本量大小、分析方法及偏倚、疾病的表型定義、生物學(xué)復(fù)雜性、人群種族之間的異質(zhì)性及環(huán)境暴露以及人群分層等諸多因素有關(guān)。家系研究的設(shè)計(jì)方法可以較好地避免人群分層等因素的影響,因而已被應(yīng)用到許多復(fù)雜疾病的研究中。本研究室以往的研究結(jié)果表明,IL-1B-511和IL-1A+4845位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms,SNP)可能與中國(guó)AgP患者的易感性有關(guān),但這種關(guān)聯(lián)性有待于在家系人群中得到證實(shí)。因此,本研究目的是對(duì)AgP患者及其親屬IL-1B-511和IL-1A+4845位點(diǎn)的SNP及IL-1RN第二內(nèi)含子中的可變數(shù)目重復(fù)序列(variablenumbertandemrepeats,VNTR)的多態(tài)性與AgP的易感性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。1數(shù)據(jù)和方法1.1研究對(duì)象的選取2001年7月至2007年6月期間在北京大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科門診確診的215例AgP患者中能提供親屬的72例AgP患者被確定為先證者,本研究選取資料完整的66例AgP先證者及其114例親屬(主要為一級(jí)親屬)作為研究對(duì)象。本研究已通過北京大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。1.2試驗(yàn)程序1.2.1組織和兒童、藥品等因素的納入及診斷(1)AgP的確診及納入:AgP的確診參照1999年牙周病分類法國(guó)際研討會(huì)所制定的標(biāo)準(zhǔn),納入條件包括:年齡小于36歲;快速的牙槽骨破壞和附著喪失;全口至少有2顆牙(其中一顆為第一磨牙)的探診深度≥5mm,鄰面附著喪失≥3mm,每名患者均攝全口根尖片證實(shí)有鄰面牙槽骨吸收;患者除患牙周炎外,全身健康,無糖尿病、心血管疾病和血液性疾病等系統(tǒng)性疾病;女性未懷孕及哺乳。對(duì)同意參加本研究并愿意邀請(qǐng)其血緣親屬一起加入研究的AgP患者被確定為先證者,簽署侵襲性牙周炎先證者知情同意書后納入研究。(2)親屬的納入及診斷:主要采用SWISS研究中介紹的先證者引薦法(proband-initiatedenrollment),接受先證者邀請(qǐng)的家系成員自愿參加本研究,并愿意進(jìn)行牙周檢查和提供血樣,在簽署侵襲性牙周炎親屬知情同意書后納入研究。親屬的診斷參照1999年牙周病分類法和現(xiàn)狀與回顧性相結(jié)合(thecurrentandretrospectivediagnosisandreportedcasehistory)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其牙周破壞狀況作出評(píng)估診斷,即利用現(xiàn)有臨床證據(jù)(包括全口根尖片、全口牙周檢查大表及口內(nèi)彩幻)并結(jié)合其口腔既往診療記錄或牙周疾病史對(duì)是否患有AgP的可能性進(jìn)行評(píng)分后做出評(píng)估。根據(jù)其可以診斷為AgP可靠程度的不同,定義為確定、較確定和可能患者3種診斷類型。由于可能患者患AgP的證據(jù)相對(duì)較少,故在本研究中將可能患者歸為非患者組。1.2.2有關(guān)牙周疾病史的史所有研究對(duì)象在納入后都進(jìn)行面對(duì)面問卷調(diào)查(包括一般人口學(xué)資料、詳細(xì)的牙周疾病家族史、牙周疾病史、既往診療史及行為危險(xiǎn)因素如口腔衛(wèi)生習(xí)慣、吸煙情況等),有關(guān)牙周疾病的病史及家族史的問卷內(nèi)容主要為自己(和/或)血緣親屬有無牙齦出血、牙齦腫痛、牙齒松動(dòng)及缺失牙情況。1.2.3牙科周檢查由課題組研究人員對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行全口牙周檢查,完成牙周檢查大表的記錄,并攝全口根尖片和拍攝全口彩色口內(nèi)照片。1.2.4空腹靜脈采血所有研究對(duì)象都按預(yù)約時(shí)間抽取空腹靜脈血。1.3pcr產(chǎn)物的純化基因組DNA的提取:采用小量外周血白細(xì)胞基因組DNA快速抽提純化試劑盒?；蛐偷臋z測(cè)及質(zhì)量控制:(1)IL-1PCR擴(kuò)增各多態(tài)性位點(diǎn)目的片段所用引物序列、擴(kuò)增反應(yīng)體系、退火溫度以及相應(yīng)酶切反應(yīng)條件參見文獻(xiàn)。(2)為了確認(rèn)酶切結(jié)果的準(zhǔn)確性,在每次酶切反應(yīng)時(shí)均設(shè)立了陽性對(duì)照(PCR產(chǎn)物純化后直接測(cè)序證實(shí)的雜合子),并對(duì)雜合型個(gè)體按照20%的比例隨機(jī)選擇進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序。本研究使用的主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑盒有:PCR擴(kuò)增儀PTC-200、PTC-100(美國(guó)gene公司);ABI9700、2400(美國(guó)生物用品系統(tǒng)公司);GENESnap凝膠成像系統(tǒng)和ABIPRISM3100遺傳分析儀(美國(guó)生物用品系統(tǒng)公司);小量外周血白細(xì)胞基因組DNA快速抽提純化試劑盒(上海華舜生物工程有限公司);PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒(美國(guó)Omega公司);公司合成引物(北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司);PCR反應(yīng)相關(guān)試劑(包括TaqDNA聚合酶,dNTP,10×PCRbuffer;北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司);限制性內(nèi)切酶(TaKaRa寶生物工程有限公司)。1.4關(guān)聯(lián)強(qiáng)度計(jì)算方法計(jì)量資料(年齡)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,計(jì)數(shù)資料(性別及吸煙狀況)用百分比表示,分別采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)對(duì)這些資料進(jìn)行各診斷組的分布差異的比較?；蛐?等位基因與AgP的關(guān)聯(lián)分析采用Logistic回歸模型;檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,關(guān)聯(lián)強(qiáng)度采用比值比(oddsratio,OR)和95%可信區(qū)間(confidenceintervals,CI)表示,以上統(tǒng)計(jì)分析過程采用SAS8.2軟件完成。本研究同時(shí)還采用了以家系為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)(family-basedassociationtest,FBAT)的方法,分析IL-1基因多態(tài)性與AgP臨床表型的關(guān)聯(lián)。FBAT方法是以核心家系為單位計(jì)算每個(gè)核心家系數(shù)的基因型的分布概率和統(tǒng)計(jì)量“S”(統(tǒng)計(jì)量S為表型T與基因型X的乘積),然后累加各核心家系的統(tǒng)計(jì)量S及S的方差與協(xié)方差,進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。該方法適用于家系資料不完全及一些表型資料缺失的情況,需要用一定的遺傳模型描述遺傳表型中基因的效應(yīng),本研究采用顯性、隱性、加性遺傳模型進(jìn)行檢驗(yàn)。2agp患者年齡分布114例血緣親屬中的成員組成為:父親37例,母親43例,同胞29例,祖父母3例,子女2例,一級(jí)血緣親屬占97.37%(111/114),所以本研究屬于核心家系研究。研究對(duì)象的基本資料如表1所示,先證者及其親屬的性別比均為女性偏高,先證者中男女性別比為1∶2.14(21/45),親屬中男女比例1∶1.15(53/61),兩組相比分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.061);先證者的年齡(25.6±6.3)明顯小于親屬(47.2±13.8;P=0.000);親屬中吸煙的比例明顯高于先證者(P=0.006)。親屬的診斷參照1999年新分類和現(xiàn)狀與回顧性相結(jié)合的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)做出評(píng)估,114名親屬中12名為“確定”AgP患者,占10.5%(12/114),45名為“較確定”AgP患者,占39.5%(45/114),二者共占50%(57/114),歸為AgP患者組;其余30名為“可能”AgP患者,27名為非AgP患者,由于可能AgP患者患AgP的證據(jù)較少,較容易與AgP區(qū)分,所以將其合并到非AgP患者組中,即共有57名非AgP患者,占50%(57/114)。分組后的基本資料如表2所示,各組之間性別及吸煙狀況差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。確定AgP患者的年齡略小于非AgP患者[(41.2±12.4)歲vs(43.3±15.6)歲,P=0.67];但較確定AgP患者的年齡[(53.9±8.1)歲]明顯大于非AgP患者的年齡[(43.3±15.6)歲,P=0.000],確定患者和較確定AgP患者的平均年齡也明顯大于非患者年齡[(51.2±10.4)歲vs(43.3±15.6)歲,P=0.002]。IL-1等位基因及基因型與AgP的關(guān)聯(lián)分析:IL-1基因各位點(diǎn)等位基因/基因型在AgP先證者與親屬之間及親屬各組之間的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05;表1,2)。以家系為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)也未發(fā)現(xiàn)IL-1基因各位點(diǎn)的多態(tài)性與AgP存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián),即IL-1B-511和IL-1A+4845等位基因1在加性、顯性及隱性3種遺傳模型的檢驗(yàn)中,P值均大于0.05(表3)。然而,當(dāng)把所有AgP患者按照全口牙槽骨吸收特點(diǎn)進(jìn)行亞型分型(分為以局限型破壞為主型和廣泛型兩組)并經(jīng)Logistic回歸模型調(diào)整了年齡、性別和吸煙狀況后發(fā)現(xiàn),以局限型破壞為主型的AgP患者組(n=16)與非AgP患者組(n=57)的IL-1B-511基因型及等位基因的分布明顯不同,以局限型破壞為主的AgP患者A1A1基因型頻率顯著高于非AgP患者(43.8%vs22.8%,OR=7.32,95%CI=1.84~29.11,P=0.005),等位基因A1的頻率也顯著升高(71.9%vs41.2%,OR=3.64,95%CI=1.55~8.58,P=0.002;表4)。沒有發(fā)現(xiàn)廣泛型的AgP患者與非AgP患者兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3agp患者亞型分型的實(shí)踐意義和預(yù)測(cè)結(jié)果本研究目前難以收集到數(shù)代人的大家系,所以主要收集了侵襲性牙周炎患者的核心家系資料。在數(shù)據(jù)分析時(shí)我們采用了以家系為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)方法(在牙周病學(xué)的相關(guān)研究中尚未見報(bào)道),為今后開展牙周炎家系的研究提供了一些依據(jù)和分析方法。本研究中66例先證者的男女性別比為1∶2.14,存在較明顯的性別差異,親屬各組男女性別比接近1∶1。先證者存在較明顯的性別差異的原因可能與其他研究所報(bào)道的因牙齒原因就診的女性多于男性而導(dǎo)致研究對(duì)象選擇的偏倚有關(guān),而并非疾病所致。多數(shù)AgP先證者的親屬在接受檢查時(shí)的年齡均已超過35歲,本研究中親屬的平均年齡為47.2歲(47.2±13.8)。雖然1999年牙周病分類法已經(jīng)提出年齡不是診斷AgP嚴(yán)格的限制,但對(duì)于年齡超過35歲的人群,僅靠現(xiàn)有的全口牙周檢查大表是不足以作出診斷的,所以本研究對(duì)于AgP先證者家庭成員的診斷借鑒Hodge等的方法,采用現(xiàn)有檢查(包括全口牙周檢查大表、X線片及彩幻)與病史回顧相結(jié)合進(jìn)行有效評(píng)估,形成一個(gè)評(píng)估系統(tǒng)。根據(jù)其可以診斷為AgP的可靠程度的不同,分為3種類型:即確定患者、較確定患者和可能患者。Hodge等所分析的是一個(gè)擴(kuò)大的大家系,以全口牙周檢查記錄作為診斷牙周炎的最準(zhǔn)確方法,在無法獲得全口牙周檢查記錄時(shí)則采用以往的病歷記錄,當(dāng)臨床診療記錄無法獲得時(shí)則采用病史回顧,并且沒有對(duì)所有家屬進(jìn)行X線診斷。本研究中,所有先證者都有全口牙周檢查大表和X線片的全面診斷,絕大部分親屬也都有X線診斷、全口的牙周檢查記錄大表及全口彩色口內(nèi)照片,在此基礎(chǔ)上結(jié)合病史對(duì)其進(jìn)行評(píng)分做出評(píng)估診斷,可以更加提高診斷的準(zhǔn)確率。但即使這樣,我們對(duì)年齡大的患者的診斷仍然是比較謹(jǐn)慎的,在對(duì)親屬的診斷中,最后納入“確定”患者的數(shù)目(12例)比“較確定”患者的數(shù)目(45例)低,可能對(duì)結(jié)果的分析會(huì)有些影響。但把二者合并為一組時(shí),可能會(huì)減少這種影響和差異,所以我們分析了個(gè)別組又同時(shí)分析了合并組。本研究的結(jié)果顯示,IL-1各位點(diǎn)的基因型/等位基因在AgP先證者與親屬之間及親屬各組之間的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以家系為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)也未發(fā)現(xiàn)IL-1等位基因各位點(diǎn)的多態(tài)性與AgP在3種遺傳模型中存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)。然而,當(dāng)將所有AgP患者按照全口牙槽骨吸收特點(diǎn)進(jìn)行亞型分型(分為局限破壞為主型和廣泛型兩組),并經(jīng)Logistic回歸模型調(diào)整了年齡、性別和吸煙狀況后我們發(fā)現(xiàn),以局限破壞為主型的AgP患者(累及牙數(shù)可能會(huì)多于3個(gè)非第一磨牙和切牙,但破壞仍以第一磨牙和切牙為主,所以稱為以局限破壞為主型,其實(shí)是1999年牙周病分類中局限型AgP的擴(kuò)展)在IL-1-511位點(diǎn),A1A1基因型及等位基因A1的頻率均顯著高于非AgP患者。我們沒有發(fā)現(xiàn)廣泛型的AgP患者與非AgP患者兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示兩種亞型有可能具有不同的發(fā)病機(jī)制或易感因素。由于以局限破壞為主型的AgP患者數(shù)量較少,所以未用FBAT檢驗(yàn)其關(guān)聯(lián)性。IL-1B-511位點(diǎn)位于IL-1B啟動(dòng)子區(qū),存在一個(gè)C(A1)→T(A2)的替換,這一單堿基的替換與IL-1B-31位點(diǎn)T(A1)→C(A2)的替換幾乎是完全連鎖不平衡的。體外凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)證實(shí)IL-1B-511位點(diǎn)的SNP并未改變DNA的結(jié)合活性,提示IL-1B-511位點(diǎn)多態(tài)性的效應(yīng)可能是通過與IL-1B-511連鎖不平衡并且與TATA盒有關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)IL-1B-31介導(dǎo)的。最近的一項(xiàng)研究表明,功能性SNPIL-1B-31位點(diǎn)不僅與TATA盒有關(guān),而且與CCAAT盒也有關(guān)系,即其顯示出與兩種轉(zhuǎn)錄因子(核心啟動(dòng)子和上游啟動(dòng)子元件)都結(jié)合的活性,意味著該位點(diǎn)單個(gè)堿基變異而導(dǎo)致的基因表達(dá)在人群中可能會(huì)有明顯的生物學(xué)影響。關(guān)于基因型對(duì)IL-1表達(dá)的確切作用尚未完全闡明,但是日本的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),IL-1B-511位點(diǎn)的基因型與帕金森病的發(fā)病年齡相關(guān),IL-1B-511A1A1基因型的患者平均發(fā)病年齡比A2A2基因型的患者早5.3年[(54.1±8.2)歲vs(59.4±9.2)歲,P=0.013]。Rodrigo等對(duì)西班牙的255名腎移植術(shù)后患者的感染情況分析顯示,