病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課2腸道病原菌的分離與鑒定

腸道病原菌的分別與鑒定一培育基的制備及常用培育基細(xì)菌的培育法EMB培育基的制備腸道病原菌的分別與鑒定〔一〕血清學(xué)檢測(cè)-肥達(dá)氏反響培育基的制備(一)肉湯培育基資料：鮮牛肉、蛋白胨、氯化鈉、pH試紙、10％碳酸氫鈉、試管、三角燒瓶、蒸餾水等。方法1．將新穎牛肉500g切碎或攪碎，加水1000ml，放4℃冰箱或冷處浸泡過夜，然后煮沸30min，放涼，使剩余的脂肪凝固，再用絨布或?yàn)V紙過濾，將濾液補(bǔ)足為原量。2．1000ml肉水中參與蛋白胨10g、氯化鈉5g，加熱溶解。3．用精細(xì)pH試紙測(cè)酸堿度，用10％碳酸氫鈉校正pH為7.2左右。過堿時(shí)，可用10％醋酸校正之。4．分裝于試管中或三角燒瓶中，15磅(121℃)高壓蒸氣滅菌20～30min。高壓蒸汽滅菌器(二)普通瓊脂培育基資料：肉水、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、無菌平皿、滅菌試管、三角燒瓶等。方法1．按上記數(shù)量把肉水、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂放到三角燒瓶中，加熱溶化。2．用pH試紙測(cè)酸堿度，用10％碳酸氫鈉校正pH為7.2左右。3．15磅高壓蒸氣滅菌20～30min。4．趁熱將溶化的培育基倒入滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)平皿倒入約15ml，凝固后即成普通瓊脂平板培育基；如趁熱將培育基倒入滅菌試管內(nèi)，再將試管斜放實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，凝固后即成普通瓊脂斜面培育基。(三)血液瓊脂培育基有些細(xì)菌其營(yíng)養(yǎng)要求較高，在普通瓊脂培育基上生長(zhǎng)不良，可用血液瓊脂培育基進(jìn)展培育。資料①普通瓊脂培育基②血液(脫纖維羊血或兔血)方法1．加熱溶化普通瓊脂培育基。2．待冷至50℃左右時(shí)，參與無菌的脫纖維血液，混勻(留意勿使產(chǎn)生泡沫)。3．分注于滅菌試管或平皿中制成血斜面和血平板培育基。E.M.B瓊脂培育基的制備成分蛋白胨10g磷酸氫二鉀2g瓊脂20g乳糖溶液(20％)50ml伊紅溶液(2％)20ml美藍(lán)溶液(0.5％)20ml蒸餾水1000ml制法①將蛋白胨和磷酸氫二鉀加溫溶化于蒸餾水中②校正pH值為7.6參與瓊脂③煮沸溶化過濾后分裝三角瓶中，每瓶定量分裝④15磅30min高壓滅菌⑤以無菌操作法按量參與經(jīng)10磅20min高壓滅菌的乳糖、伊紅美蘭液，混勻后傾注平皿備用。E.M.B培育基原理大腸桿菌能分解乳糖產(chǎn)酸，使培育基pH值下降，伊紅與美藍(lán)相結(jié)合成一種復(fù)合物，酸性環(huán)境中，菌體帶正電，易與伊紅結(jié)合，故菌落呈紫黑色或紫紅色，并有金屬光澤。堿性環(huán)境中伊紅與美藍(lán)不結(jié)合，病原菌不分解乳糖，不產(chǎn)酸故菌落為無色半透明。其次，伊紅、美藍(lán)有抑制革蘭氏陽性菌生長(zhǎng)的作用。用途用于分別腸道致病菌，是一種鑒別培育基。并有弱的選擇作用。肥達(dá)氏反響肥達(dá)氏反響通常用知的傷寒桿菌“O〞、“H〞菌液和甲、乙型副傷寒桿菌“H〞菌液與病人血清作定量凝集實(shí)驗(yàn)(試管法)，以檢測(cè)病人血清中有無相應(yīng)抗體存在，根據(jù)抗體含量多少及增長(zhǎng)情況用于傷寒、副傷寒病的輔助診斷。資料①待檢可疑傷寒病人血清(1:10稀釋)②診斷菌液：傷寒桿菌“O〞(O)傷寒桿菌“H〞(OH)甲型副傷寒桿菌“H〞(PA)乙型副傷寒桿菌“H〞(PB)③生理鹽水④吸管，小試管等。方法本實(shí)驗(yàn)四人一組，每人取6只小試管，排成一列，計(jì)四列為一完好實(shí)驗(yàn)。分別標(biāo)明每列管號(hào)和診斷菌液如“O〞、“OH〞、“PA〞、“PB〞。按下表先向每管加生理鹽水0.5ml，再加10倍稀釋病人血清0.5ml于第l管，做順序的等倍稀釋，最后參與等量的診斷菌液，充分混勻，置37℃2~4h，再放室溫24小時(shí)后察看結(jié)果。試管123456生理鹽水（ml）0