【腐敗水果微生物分離與鑒定探究4200字（論文）】

腐敗水果微生物分離與鑒定探究目錄TOC\o"1-2"\h\u957腐敗水果產(chǎn)生的微生物研究 127792一、緒論 1245621.1水果腐敗易產(chǎn)生的微生物 1283341.2腐敗微生物分離鑒定的方法 1288022.1試驗(yàn)材料 3263312.2試驗(yàn)方法 3160013.1腐敗微生物的分離純化 5156033.2水果腐敗微生物細(xì)菌的鑒定 520767結(jié)論 718178參考文獻(xiàn) 9摘要：在我國(guó)水果種植面積大，產(chǎn)量豐富，對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)中起著很大作用，然而水果在采收后極易受到微生物的侵害，并且在運(yùn)輸中逐漸腐敗，對(duì)水果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有著明顯的阻礙作用。本文主要研究水果腐敗微生物的細(xì)菌，并對(duì)其采用組織分離法對(duì)引起水果腐敗微生物的細(xì)菌進(jìn)行分離純化，了解水果腐敗后所產(chǎn)生的微生物菌落。利用形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，確定引起水果腐敗的微生物的種類。結(jié)果分析：通過分離純化分離出兩種菌株，再通過形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定出，兩種菌株都為芽孢桿菌屬，最后經(jīng)過16SrDNA通用引物擴(kuò)增細(xì)菌兩種菌落，測(cè)序PCR產(chǎn)物，并進(jìn)行同源性分析，最終確認(rèn)兩種菌株分別為巨大芽孢桿菌和假蕈狀芽孢桿菌。關(guān)鍵詞：水果腐?。晃⑸?；研究一、緒論1.1水果腐敗易產(chǎn)生的微生物水果中引起腐敗常見的微生物主要有細(xì)菌、酵母菌、霉菌。1.2腐敗微生物分離鑒定的方法1.2.1分離的方法微生物的分離方法主要有組織分離法、稀釋涂布平板法、平板劃線法這三種。不需要特殊儀器，分離純化的效果還很好，所以最常用的有這三種。組織分離法：也叫無性分離法，是利用子實(shí)體的組織塊，在適宜的培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件下分離、培育純菌絲的一種簡(jiǎn)易方法。這種分離法操作容易，后代能保持原菌株的優(yōu)良性，不易發(fā)生變異。涂布平板法：由固體介質(zhì)上的微生物形成的單一菌群，即是由單個(gè)細(xì)胞設(shè)計(jì)的計(jì)數(shù)方法來重現(xiàn)這種培養(yǎng)特征。為了將樣品轉(zhuǎn)化為均勻稀釋劑，需要使樣品中的微生物細(xì)胞分散，便于單個(gè)細(xì)胞存在，然后采取一定的稀釋和一定數(shù)量的稀釋劑接種斑塊，使其均勻分布在斑塊中間[1]。平板劃線法：通過平板劃線獲得微生物純培養(yǎng)的方法。一種從混合微生物或不同的細(xì)胞中獲得更獨(dú)立分布的單個(gè)細(xì)胞，并將其生長(zhǎng)成一個(gè)菌群的方法。1.2.2鑒定的方法傳統(tǒng)方法傳統(tǒng)的微生物鑒定方法依賴于表型識(shí)別，主要是通過染色、培養(yǎng)和簡(jiǎn)單的生化測(cè)試。1.宏觀特征：宏觀特征包括微生物的整體外觀、形狀、大小、顏色、氣味等，肉眼可見。通過檢測(cè)瓊脂培養(yǎng)基中的形態(tài)或宏觀特征來確定微生物的種類。同一物種在不同的培養(yǎng)基中表現(xiàn)出不同的表現(xiàn)。2.微觀特征：微生物通常在顯微鏡下通過染色更容易顯示出來[2]。最常用的染色方法如下：（1）革蘭氏染色法細(xì)菌鑒定的首選就是革蘭氏染色法，基于結(jié)晶性的紫色染料。芽孢桿菌、葡萄球菌、鏈球菌和梭狀芽孢桿菌都是典型的革蘭氏陽(yáng)性菌,而革蘭氏陰性菌則有大腸桿菌、幽門螺桿菌和沙門氏菌。但有些細(xì)菌是革蘭氏染色不確定的，不適合革蘭氏染色法。（2）芽孢染色這項(xiàng)技術(shù)包括將染料應(yīng)用到細(xì)菌樣品中，是為了檢測(cè)孢子的存在。這些信息在鑒定中是很重要的，因?yàn)椴皇撬屑?xì)菌都可以產(chǎn)生孢子。最受歡迎的孢子染色劑可能就是孔雀石綠。3.簡(jiǎn)單的生化測(cè)試：主要有過氧化氫酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、底物利用率測(cè)試、二叉式檢索表?，F(xiàn)代方法雖然傳統(tǒng)的鑒定方法依舊被廣泛使用，但有兩個(gè)缺點(diǎn)。它們只適用于可以在體外培養(yǎng)的生物體，而且一些菌株表現(xiàn)出獨(dú)特的生化特性，不符合已知物種模式的生化特性。許多現(xiàn)代的方法并不依賴于活的培養(yǎng)物，它們經(jīng)常能發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法無法檢測(cè)到的生物體之間的不可察覺的差異。方法有PCR鑒定、微陣列芯片識(shí)別、免疫學(xué)和化學(xué)分析鑒定[3]。第2章材料與方法2.1試驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)所需試劑主要有：葡萄糖、瓊脂粉、氯化鈉、二氧化氯、無水乙醇、結(jié)晶紫、碘化鉀、碘、番紅、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏實(shí)驗(yàn)所需儀器主要有電子天平、蒸汽滅菌鍋、顯微鏡、霉菌培養(yǎng)箱、PCR儀、離心機(jī)等，如表1所示。表1實(shí)驗(yàn)所需儀器情況設(shè)備名稱產(chǎn)地電子天平手提式壓力蒸汽滅菌鍋恒溫培養(yǎng)振蕩器超凈工作臺(tái)生物顯微鏡恒溫水浴鍋霉菌培養(yǎng)箱瓊脂糖凝膠電泳PCR儀離心機(jī)賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司紹興萬力儀器有限公司上海智城分析儀器制造有限公司南京貝登醫(yī)療股份有限公司上海正晞儀器設(shè)備有限公司江蘇新春蘭科學(xué)儀器有限公司上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠上海金鵬分析儀器有限公司\o"北京創(chuàng)譽(yù)科技有限公司"北京創(chuàng)譽(yù)科技有限公司湘儀離心機(jī)儀器有限公司2.2試驗(yàn)方法2.2.1分離純化挑選無機(jī)械傷、無病蟲害、成熟度一致的水果，進(jìn)行消毒之后擦干，將水果放置在4℃恒溫環(huán)境中，待果實(shí)出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象時(shí)，切除腐敗部位與正常部位交接處進(jìn)行消毒處理，放入裝有無菌水的三角瓶中，制成水果懸浮液。將稀釋度不同的水果懸浮液吸取于NA培養(yǎng)基上，均勻涂布，將NA培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2小時(shí)。結(jié)束后根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、大小的區(qū)別，對(duì)平板上的菌落進(jìn)行劃線分離，直到得到培養(yǎng)物[4]。2.2.2回接實(shí)驗(yàn)首先對(duì)水果進(jìn)行清洗干凈，然后進(jìn)行消毒，用無菌水沖洗之后晾干，在無菌操作中將水果的中間部分用打孔器打出對(duì)稱的幾個(gè)小孔，在小孔處分別接入20μL篩選出的致腐菌的懸浮液，以無菌生理鹽水作為對(duì)照。在水果接種后用保鮮膜包裹住。之后講被保鮮膜包裹住的水果放置在28℃恒溫環(huán)境中，進(jìn)行具體觀察，觀察在該過程中發(fā)生的組織變化和腐爛情況，根據(jù)最終的情況確定該菌是否為主要的致腐菌。再次進(jìn)行分離純化在回接后腐爛的組織上，判斷是否與最初接種的菌種是否一致[5]。2.2.3細(xì)菌鑒定將水果分離純化后的菌株放置在NA培養(yǎng)基上，并劃線培養(yǎng)1~2小時(shí)，之后進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，觀察形態(tài)、大小、顏色，透明度、邊緣結(jié)構(gòu)、表面光滑度、菌落隆起形狀、表面狀態(tài)等，然后與標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行對(duì)比，并對(duì)其進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，試驗(yàn)主要包括過氧化氫酶活性試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、葡萄糖水解試驗(yàn)、阿拉伯糖水解試驗(yàn)、木糖水解試驗(yàn)、甘露醇水解試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、Nacl耐受性試驗(yàn)等。挑取細(xì)菌平板上的單菌落，接種于NB培養(yǎng)基上，搖床培養(yǎng)，溫度為37℃，時(shí)間為12小時(shí)，取2mL菌液10000g離心1min，之后撇去上清液，按照天根公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌的基因組DNA[6]。提取細(xì)菌的基因組DNA步驟如下：（1）100ml細(xì)困培養(yǎng)液5000rpm離心10分鐘，去上清液。加9.5mlTE懸浮沉淀，并加05mL10%SDS，50μL20mg/ml（或1mg干粉)蛋白酶K，混勻，37℃保溫一個(gè)小時(shí)。（3）加1.5ml5mol/LNaCl，混勻。（4）加1.5mlCTAB/NaCl溶液混勻65℃保溫20分鐘。（5）用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提，5000rpm離心10分鐘，將上清液移至干凈離心管。（6）用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提，取上清液移至干凈管中。（7)加1倍體積異丙醇，顛倒混合，室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。（8)用玻棒撈出DNA沉淀70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于1mlTE,-20℃保存。如DNA沉淀無法撈出，可5000rpm離心，使DNA沉淀。最終可以獲得較為完成的DNA分子。采用擴(kuò)增細(xì)菌的16SrDNA通用引物，前引物63F（5ˊ-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3ˊ），后引物為1387R（5ˊ-CCCGGGATCCAAGCTTAAG-3ˊ）擴(kuò)增目標(biāo)細(xì)菌的16SrDNA，引物由北京六合華大科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（50μL）為：模板DNA3μL，5×Buffer（含Mg2+）10μL，dNTP（各2.5mmol/L）4μL，10μmol/L27F和1492R引物各1μL，酶1μL，ddH2O30μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃下預(yù)變性5分鐘；95℃變性10秒，50℃退火15s，然后72℃延伸1分鐘，需要循環(huán)33次，最終72℃下修復(fù)延伸5分鐘，最后等到溫度降到11℃時(shí)終止反應(yīng)。取5μL的PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其他的PCR產(chǎn)物在4℃下冷藏，用凝膠成像系統(tǒng)，觀察它的電泳條帶，確認(rèn)是否有目的性條帶顯現(xiàn)。之后將PCR產(chǎn)物在擎科嘉美生物科技有限公司測(cè)序，然后分析序列，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[7]。第3章結(jié)果與分析3.1腐敗微生物的分離純化從腐敗的水果中首先分離出兩株細(xì)菌，分別給他們命名為G1、G2。然后再將分離出的這兩種菌株接種到新鮮、無腐敗現(xiàn)象的且經(jīng)過消毒殺菌的水果表皮上。之后表皮呈現(xiàn)褐色的班點(diǎn)，斑點(diǎn)先是為淺褐色，后變?yōu)樯詈稚⑾蛑車鷶U(kuò)散，水果表皮變軟。將回接后腐敗的水果部位再次進(jìn)行微生物分離，菌株在分離純化后都與所接種的菌株相同。由此可見，細(xì)菌G1和G2是可以引起水果腐敗的微生物。3.2水果腐敗微生物細(xì)菌的鑒定3.2.1細(xì)菌G1鑒定結(jié)果觀察細(xì)菌G1可知菌落顏色為乳白色，表面光滑有光澤，濕潤(rùn)度良好，整體呈圓形，凸起，較易取下來。在光學(xué)顯微鏡下觀察到，菌落為長(zhǎng)桿狀，單個(gè)呈現(xiàn)短鏈狀或者成對(duì)出現(xiàn)，可以生成芽孢。利用生理生化實(shí)驗(yàn)可以得知細(xì)菌G1可以水解淀粉，V-P試驗(yàn)與過氧化氫酶試驗(yàn)都呈陽(yáng)性，對(duì)氯化鈉的耐受性時(shí)7％。綜述可得可以初步判定G1菌落為言胞桿菌屬。a1（細(xì)菌菌落）a2（光學(xué)顯微鏡下）構(gòu)建的細(xì)菌G1的16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹：細(xì)菌G1鑒定結(jié)果通過16SrDNA通用引物擴(kuò)增細(xì)菌G1菌落的16SrDNA序列，測(cè)序PCR產(chǎn)物。之后將測(cè)的序列在NCBI基因庫(kù)中與已經(jīng)登錄的其他菌落序列進(jìn)行BLAST同源性分析。再通過MAGE7.0對(duì)菌落G1的測(cè)序結(jié)果和同源性高的基因序列對(duì)比，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最終發(fā)現(xiàn)G1菌落與巨大芽孢桿菌遺傳的距離最近，同源性也達(dá)到了百分之百，其形態(tài)與生理生化反應(yīng)的結(jié)果也很相似，因此可以認(rèn)定菌落G1是巨大芽孢桿菌。3.2.1細(xì)菌G2鑒定結(jié)果由圖可見，G2細(xì)菌的菌落呈乳白色,不透明，邊緣不圓整，表面不光滑、不隆起?？梢援a(chǎn)生生物表面活性劑，能使發(fā)酵液的表面張力值降低到34.2mN·m-1，最適生長(zhǎng)溫度為30℃。生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果為：能水解淀粉，V-P試驗(yàn)與過氧化氫酶試驗(yàn)都呈陽(yáng)性。對(duì)氯化鈉耐受為7%，種種結(jié)果都與芽孢桿菌一致，可初步判定菌落G2為芽孢桿菌屬。a1（細(xì)菌菌落）a2（光學(xué)顯微鏡下）細(xì)菌G2鑒定結(jié)果通過16SrDNA通用引物擴(kuò)增G1菌落，測(cè)序PCR產(chǎn)物。之后將測(cè)的序列在NCBI基因庫(kù)中與已經(jīng)登錄的其他菌落序列進(jìn)行BLAST同源性分析。根據(jù)同源性分析的結(jié)果，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最終發(fā)現(xiàn)G2菌落與假蕈狀芽孢桿菌遺傳的距離最近，同源性也達(dá)到了百分之百，其形態(tài)與生理生化反應(yīng)的結(jié)果也很相似，因此可以認(rèn)定菌落G1是假蕈狀芽孢桿菌。結(jié)論如今國(guó)內(nèi)外水果產(chǎn)業(yè)的科研工作取得較大進(jìn)展，本研究對(duì)水果腐敗微生物進(jìn)行了分離純化，獲得了兩種菌株，之后對(duì)分離出來的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化實(shí)驗(yàn)、16SrDNA分子序列測(cè)序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最后鑒定出G1菌株為巨大芽孢桿菌，G2菌株為假蕈狀芽孢桿菌。本文分離鑒定出了會(huì)使水果腐敗的細(xì)菌微生物，同時(shí)對(duì)其他果蔬等也會(huì)造成腐敗的現(xiàn)象，如今果蔬易腐敗現(xiàn)象已普遍存在，對(duì)于能引起果蔬腐敗的微生物也是有很大不同，只有清楚微生物的具體種類才能針對(duì)性地進(jìn)行瓜果防腐。參考文獻(xiàn)[1]李想.靜電噴檸檬香茅/蜂蠟復(fù)合微球制備及其芒果保鮮效果研究[D].浙江工商大學(xué),2019.[2]黃榮,王曉麗,王兆升,李游,方雙杰.皺皮木瓜腐敗微生物的分離鑒定[J].食品科學(xué),2021,42(04):161-166.[3]韓千慧,岳琪琪,吳忌,艾有偉,王宏勛,侯溫甫.曲酸對(duì)冷鮮鴨肉腐敗微生物致腐能力的影響研究[J].