【微流控芯片在船舶壓載水檢測(cè)中的應(yīng)用分析15000字（論文）】

微流控芯片在船舶壓載水檢測(cè)中的應(yīng)用研究摘要船舶是國(guó)際貿(mào)易和運(yùn)輸?shù)闹饕ぞ?，其攜帶的壓載水是傳播海洋生物傳播的主要途徑。微藻是壓載水檢測(cè)中非常重要的檢測(cè)目標(biāo)，對(duì)壓載水中的微藻進(jìn)行快速、自動(dòng)的檢測(cè)和識(shí)別尤為重要。本文提出了一種基于微流控芯片的船舶壓載水中單個(gè)微藻活性檢測(cè)和分類的新方法。該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)提出了一種新的檢測(cè)方法，通過激光誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒鈾z測(cè)原理檢測(cè)微藻的存活狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)壓載水的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。與現(xiàn)有的流式細(xì)胞儀等藻類檢測(cè)方法相比，該生物傳感器檢測(cè)系統(tǒng)具有成本低、數(shù)量少、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了快速、有效、便攜的壓載水檢測(cè)目標(biāo)。關(guān)鍵詞：微流控芯片，壓載水，微藻檢測(cè)目錄TOC\o"1-3"\h\u79271緒論 1283831.1研究的目的與意義 1271011.1.1研究目的 1143221.1.2研究意義 1212391.2常見藻類檢測(cè)及分類方法 2273341.2.1流式細(xì)胞術(shù)法 2160521.2.2光學(xué)分析及成像方法 3120441.2.3光學(xué)色素分析法 379472微流控芯片技術(shù) 4152702.1微流控芯片技術(shù)的原理 4207352.2微流控芯片技術(shù)的發(fā)展歷程 6319112.3微流控芯片的微藻檢測(cè)技術(shù) 6284223微流控芯片在船舶壓載水檢測(cè)中的應(yīng)用 8201193.1微流控芯片技術(shù)檢測(cè)船舶壓載水中藻細(xì)胞活性的研究 819933.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 883723.1.2實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法 11255693.1.3結(jié)果與討論 1277393.2微流控芯片技術(shù)檢測(cè)船舶壓載水中藻細(xì)胞計(jì)數(shù)的研究 1767793.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 17161303.2.2結(jié)果與討論 20296994總結(jié)與展望 22250734.1總結(jié) 22213204.2不足與展望 2224767參考文獻(xiàn) 241緒論1.1研究的目的與意義1.1.1研究目的航運(yùn)業(yè)是中國(guó)經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展的重要組成部分。船舶是海上運(yùn)輸?shù)闹匾ぞ摺４爸饕揽繅狠d水來維持穩(wěn)定性。通過不斷調(diào)整水量，確保貨物順利裝卸和通航。當(dāng)船舶調(diào)整壓載水量時(shí)，海水中的細(xì)菌和有害微生物也會(huì)被裝載到船艙中。每年大約有500億噸的壓載水將裝載這些貨物。向主要海域輸送3000多種動(dòng)植物。如果壓載水直接排放到目的地，很容易造成外來生物入侵，導(dǎo)致細(xì)菌和有害微生物的危險(xiǎn)傳播，破壞當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)平衡。赤潮是最常見的海洋生態(tài)系統(tǒng)災(zāi)害。赤潮的產(chǎn)生是由于海洋微生物的大規(guī)?？刂啤：Ｑ笪⑸?，如漂浮在海水表面的魚。黃海和渤海的赤潮面積和頻率逐年增加。最終導(dǎo)致數(shù)以百萬計(jì)的經(jīng)濟(jì)損失。因此，壓載水處理的標(biāo)準(zhǔn)化是一個(gè)有效防止生物入侵的問題。各國(guó)有關(guān)機(jī)構(gòu)也更加重視這一問題，以避免或減少壓載水造成的嚴(yán)重生態(tài)問題。2004年2月，國(guó)際海事組織在相關(guān)大會(huì)上通過了壓載水公約，該公約定義了壓載水排放的具體標(biāo)準(zhǔn)。通過更換壓載水或處理壓載水，排放指標(biāo)可達(dá)到D-1標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于D-1標(biāo)準(zhǔn)，通過直流、稀釋和交換壓載水在行駛過程中完成，交換率要求為壓載水量的95%。關(guān)于D-2標(biāo)準(zhǔn)：所有船舶必須配備壓載水處理設(shè)備。壓載水排放前，通過物理、化學(xué)和其他處理方法進(jìn)行有效的滅活操作，以確保壓載水中各種微生物的含量在排放前符合以下標(biāo)準(zhǔn)：1）尺寸在50μm及以上的微生物含量小于10個(gè)/m3；（2）尺寸在10μm到50μm的微生物含量小于10個(gè)/ml；（3）指示微生物的濃度不超過以下要求：有毒霍亂弧菌不到一個(gè)菌落形成單位（CFU）。大腸桿菌含量低于250cfu/100ml；腸球菌應(yīng)低于100cfu/100ml。從上面可以看出，壓載水必須經(jīng)過測(cè)試和確定，以滿足排放標(biāo)準(zhǔn)，然后才能排出。然而，大量的壓載水以及各種微生物和雜質(zhì)的混合物會(huì)對(duì)壓載水的檢測(cè)造成重大損害，并顯著降低壓載水的檢測(cè)效率。因此，壓載水的分類和富集預(yù)處理是必要的。1.1.2研究意義目前國(guó)內(nèi)外壓載水處理技術(shù)日趨成熟，但方法多種多樣，壓載水的相關(guān)法規(guī)和排放標(biāo)準(zhǔn)也在不斷完善。在不同的治療方法中，治療后的效果在有效性、穩(wěn)定性、經(jīng)濟(jì)性和周期性方面有很大差異。壓載水處理過程中的有害物質(zhì)是否對(duì)壓載水作業(yè)中的人員有害，如壓載水作業(yè)后的使用壽命和微生物滅活率是否符合要求，以便用操作成本和壓載水處理中廣泛使用的化學(xué)方法污染環(huán)境，選擇哪種試劑不能有效地快速激活微生物，并且在系統(tǒng)受損時(shí)最低。操作和維護(hù)成本最低，是達(dá)到治療效果的前提?？梢酝ㄟ^使用最低濃度和最短時(shí)間來滿足要求。這種濃度和時(shí)間在實(shí)際工業(yè)應(yīng)用中具有重要意義。當(dāng)工藝超過此時(shí)間時(shí)，操作成本和系統(tǒng)損失增加，當(dāng)手動(dòng)操作工藝超過此增加的濃度時(shí)，材料和試劑的消耗增加，并產(chǎn)生浪費(fèi)。特別是在現(xiàn)代海上運(yùn)輸業(yè)中，每天產(chǎn)生成千上萬的船舶壓載水。在現(xiàn)有的處理技術(shù)中，沒有有效的方法和完善的系統(tǒng)，這給壓載水處理帶來了大量人力和物力的浪費(fèi)，系統(tǒng)運(yùn)行、維護(hù)成本高、周期長(zhǎng)等。壓載水處理和分離技術(shù)是基于微流控芯片實(shí)現(xiàn)的。技術(shù)原理是在微芯片上集成物理、化學(xué)、生物和其他實(shí)驗(yàn)操作。芯片內(nèi)設(shè)有微米級(jí)的液體通道，對(duì)微通道中液體的精確分析完成了樣品的分析、檢測(cè)和處理。微流控芯片具有良好的透光性、流動(dòng)性和便攜性。與宏器件相比，微流控芯片可以用少量反應(yīng)液實(shí)現(xiàn)高效、快速的處理和檢測(cè)，大大提高了壓載水藻類檢測(cè)效率。1.2常見藻類檢測(cè)及分類方法盡管公約沒有對(duì)壓載水的微生物和檢測(cè)技術(shù)提出要求，但許多壓載水處理裝置的處理效果應(yīng)通過特定的檢測(cè)手段進(jìn)行測(cè)量。對(duì)于生物檢測(cè)技術(shù)，傳統(tǒng)方法被廣泛用于研究水生生物的數(shù)量和種群，但檢測(cè)過程復(fù)雜。檢測(cè)手段操作簡(jiǎn)單，但耗時(shí)較長(zhǎng)，專業(yè)領(lǐng)域的工程師需要熟悉該領(lǐng)域。觀察過程是用肉眼判斷海洋生物生存狀況所必需的。由于海水中存在一些動(dòng)態(tài)藻類，因此可以通過移動(dòng)和顯微鏡觀察它們，這種情況很容易導(dǎo)致遺漏或重復(fù)計(jì)數(shù)。各種生物技術(shù)的不斷發(fā)展導(dǎo)致了一些簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。1.2.1流式細(xì)胞術(shù)法流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法始于20世紀(jì)70年代初，發(fā)展成熟，成為最先進(jìn)的生物定量分析技術(shù)。在功能水平上對(duì)單個(gè)細(xì)胞或其他生物顆粒進(jìn)行定量分析和篩選的方法。流式細(xì)胞儀可以快速分析數(shù)十萬個(gè)細(xì)胞，分析和分析單個(gè)細(xì)胞顆粒，同時(shí)測(cè)量細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)，可以準(zhǔn)確分析細(xì)胞的大小、數(shù)量、細(xì)胞核、細(xì)胞器和內(nèi)部物質(zhì)等細(xì)胞參數(shù)。幾種流式細(xì)胞術(shù)將光散射測(cè)量、鞘液聚焦流體驅(qū)動(dòng)原理、細(xì)胞熒光染色、激光測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)分析和數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)技術(shù)與熒光測(cè)量相結(jié)合。一些流式細(xì)胞儀還包括細(xì)胞成像、分類、脈沖形狀分析和其他功能。流式細(xì)胞術(shù)甚至可以檢測(cè)最小的光合生物原綠球菌。與傳統(tǒng)的細(xì)胞分析方法相比，流式細(xì)胞儀克服了人工操作的計(jì)數(shù)誤差，效率高，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。它是生物數(shù)量定量分析的標(biāo)準(zhǔn)方法之一，是當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)可以用來測(cè)定活細(xì)胞的存活率?；谶@一特點(diǎn)，它適用于檢測(cè)壓載水中的海洋生物數(shù)量。使用一種新的流式細(xì)胞儀技術(shù)，流成像儀可以檢測(cè)和分類海洋和污水中的浮游微生物和細(xì)胞。然而，流式細(xì)胞術(shù)被廣泛用于檢測(cè)小型微藻物種。海水、壓載水微藻樣本可能會(huì)導(dǎo)致設(shè)備產(chǎn)生生物結(jié)垢。非球形微藻在流動(dòng)過程中會(huì)產(chǎn)生不同的方向，導(dǎo)致數(shù)據(jù)缺乏和分辨率下降。引入的天然樣品（壓載水微藻樣品）的大小和形狀多種多樣，很難從樣品中區(qū)分單個(gè)微藻、碎屑或雜質(zhì)。壓載水樣本中大量的微藻、商用原位水流式細(xì)胞儀的長(zhǎng)期運(yùn)行時(shí)間以及設(shè)備的大容量和高成本是限制流式細(xì)胞儀在壓載水檢測(cè)中應(yīng)用的重要因素。1.2.2光學(xué)分析及成像方法微藻的光學(xué)鑒別主要包括光散射分析和光學(xué)成像。利用光散射分析法估算微藻的體積。測(cè)量結(jié)果可以很容易地識(shí)別微藻的大小并對(duì)其進(jìn)行識(shí)別，但不同的光散射方向可以表征微藻顆粒的不同性質(zhì)。前向散射與微藻數(shù)量、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、鹽度等因素有關(guān)。橫向散射特性受單個(gè)微藻葉綠素含量的影響，光散射分析不適用于不規(guī)則和非球形微藻顆粒，也沒有統(tǒng)一的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)，因此識(shí)別結(jié)果不明確。光學(xué)成像是比較流行的方法之一。它使用CCD對(duì)圖像中的細(xì)藻類進(jìn)行檢測(cè)，并與數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)有的形狀信息進(jìn)行比較，以確定藻類的類型。然而，存在的問題是高性能處理器硬件和實(shí)時(shí)圖像處理算法（包括數(shù)據(jù)庫(kù)建立和圖像匹配算法）限制了該方法的應(yīng)用，該方法主要用于靜態(tài)分類、數(shù)據(jù)采集的動(dòng)態(tài)分類和高速相機(jī)。1.2.3光學(xué)色素分析法光合色素在植物光合作用中起著重要作用，是微藻檢測(cè)和鑒定的良好探針。根據(jù)色素的顏色鑒別，主要有分光光度法（光譜吸收法）和熒光法。分光光度法是利用一定帶寬的光發(fā)射壓載水樣品，從而觀察吸收光波長(zhǎng)的函數(shù)。不同微藻的吸收光譜不同，因?yàn)椴煌⒃逯兴妮o助色素含量不同，但這種差異非常小，函數(shù)曲線變化很小，遠(yuǎn)程光譜測(cè)量?jī)x器和現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量?jī)x器的成本非常昂貴。熒光分析提供了有關(guān)色素相對(duì)量和絕對(duì)量的詳細(xì)信息。然而，它是一種無需樣品制備的快速實(shí)時(shí)現(xiàn)場(chǎng)識(shí)別技術(shù)。熒光測(cè)量可用于測(cè)量微藻葉綠素和輔助染料的激發(fā)熒光強(qiáng)度，并通過提供輔助染料的光譜吸收信息來識(shí)別微藻。雖然一些熒光測(cè)量?jī)x器可以識(shí)別和鑒定各種微藻，但熒光測(cè)量?jī)x器的組成過于準(zhǔn)確，成本非常昂貴。其他方法，如圖像分析、光學(xué)顯微鏡、染料熒光顯微鏡計(jì)數(shù)、原位PCR聚合酶鏈反應(yīng)計(jì)數(shù)和分子識(shí)別基因組學(xué)，也可用于檢測(cè)壓載水中的單個(gè)生物體。然而，上述方法存在一些缺點(diǎn)。例如，必要的設(shè)備昂貴且難以管理。它基本上采用了一種將樣本帶到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定的方式。此外，檢測(cè)類型相對(duì)有限，新類型無法通過缺乏了解來確認(rèn)。該方法不適用于壓載水檢測(cè)，因?yàn)橛斜匾蛴?xùn)練有素的工程師準(zhǔn)備樣品和分析結(jié)果。研究了適用于壓載水檢測(cè)技術(shù)的方法和系統(tǒng)。壓載物檢測(cè)系統(tǒng)需要便攜性、經(jīng)濟(jì)性和良好的再現(xiàn)性。2009年，在柏林城市大學(xué)舉辦的促進(jìn)和協(xié)調(diào)歐洲國(guó)家和區(qū)域海洋研究合作項(xiàng)目會(huì)議上，開展了當(dāng)前海洋環(huán)境的技術(shù)挑戰(zhàn)，包括壓載水檢測(cè)技術(shù)。在這次會(huì)議上，提議使用微流控芯片來解決探測(cè)鉆石和其他海洋環(huán)境的問題。微流控技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是壓載水檢測(cè)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。微流控芯片技術(shù)通過芯片實(shí)現(xiàn)壓載水藻類的快速自動(dòng)檢測(cè)，是一種較好的技術(shù)手段。目前，這種新的、簡(jiǎn)單的和便攜式的壓載水生物檢測(cè)方法是必要的，以確保通過不同方法處理的壓載水排放物符合IMO公約的要求。2微流控芯片技術(shù)2.1微流控芯片技術(shù)的原理微流控芯片也稱為微流控芯片實(shí)驗(yàn)室或芯片實(shí)驗(yàn)室。微流控芯片是微流控技術(shù)實(shí)用檢測(cè)的主要平臺(tái)。微流控芯片的主要特點(diǎn)是含有流體的通道為微米級(jí)，流體的操作在微空間中實(shí)現(xiàn)，化學(xué)或生物實(shí)驗(yàn)室建立在微芯片上。各種化學(xué)和生物過程可以在高速自動(dòng)微流控系統(tǒng)下完成。由于微通道與細(xì)胞之間具有良好的尺度兼容性，微通道被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞分選、細(xì)胞檢測(cè)、細(xì)胞微環(huán)境模擬和芯片器官等領(lǐng)域。（1）細(xì)胞培養(yǎng)微流控芯片的微通道尺寸相當(dāng)于單元，結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)靈活多樣。這可以有效地模擬細(xì)胞的實(shí)際生活環(huán)境，并確保生長(zhǎng)條件是無菌、無毒、透光、溫度和營(yíng)養(yǎng)所需的。它是細(xì)胞培養(yǎng)的理想工具。此外，由于大多數(shù)微流控生物反應(yīng)器具有光學(xué)透明性，并且與傳統(tǒng)成像技術(shù)兼容，因此可以進(jìn)行實(shí)時(shí)圖像分析。還可以制造廉價(jià)的一次性系統(tǒng)，以便于組裝、清潔和消毒，廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。（2）細(xì)胞分選微流控芯片細(xì)胞分類技術(shù)根據(jù)細(xì)胞的組成、結(jié)構(gòu)和大小以及背景環(huán)境中細(xì)胞的種類來識(shí)別細(xì)胞。微流控細(xì)胞分選技術(shù)根據(jù)分選機(jī)理的不同可分為主動(dòng)分選技術(shù)和被動(dòng)分選技術(shù)。利用聲、光、電、磁等外力進(jìn)行主動(dòng)分選；被動(dòng)分選方法依賴于顆粒的物理性質(zhì)，例如流場(chǎng)的特征和尺寸、形狀、硬度等，以便在不施加外力的情況下實(shí)現(xiàn)分選。常用的方法包括微結(jié)構(gòu)濾波、確定性橫向位移（DLD）、慣性分選等。聲學(xué)分選技術(shù)是在聲輻射力的作用下，在通道周圍施加超聲波場(chǎng)，產(chǎn)生懸浮顆粒。聲輻射力驅(qū)動(dòng)粒子到達(dá)壓力波節(jié)點(diǎn)或波腹位置。由于顆粒大小和密度不同，聲輻射力也不同，顆粒的最終穩(wěn)定位置也不同，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的選擇。聲分離法雖然通量大，但分離純度低，所需設(shè)備和操作復(fù)雜。光學(xué)分選使用光來操縱細(xì)胞或粒子。光鑷通常用于光分揀。光鑷的本質(zhì)是將強(qiáng)聚焦激光束施加到大于介質(zhì)折射率的粒子上。由于粒子的折射，光的傳播方向發(fā)生變化，即光子的動(dòng)量量發(fā)生變化，控制粒子在固定時(shí)間內(nèi)獲得動(dòng)量以控制粒子。雖然光鑷技術(shù)具有較高的精度、回收率和純度，但該方法通量低，不適合分離許多顆粒，所用設(shè)備昂貴，顆粒的操作距離短。最常用的電學(xué)分選是使用介電泳力進(jìn)行細(xì)胞分選和操作。介電泳最早由Pohl等人于20世紀(jì)50年代提出，1978年被引入生物和化學(xué)領(lǐng)域，用于細(xì)胞分類和操作。自那以后，研究人員引起了全世界的關(guān)注。介電泳具有較高的操作精度，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞捕獲、鑒定、聚焦、篩選等應(yīng)用研究。介電泳可分為直流介電泳、交流介電泳、行波介電泳和光誘導(dǎo)介電泳。這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。其中，交流介質(zhì)電泳因電壓低、細(xì)胞損傷小、有氣泡、熱量少等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。磁分選主要是利用磁場(chǎng)產(chǎn)生的磁力分離具有不同磁性的顆粒。磁選基本上與電分離相似。然而，與電分離相比，它有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。（1）磁鐵不與溶液接觸；（2）通常磁力不影響細(xì)胞的活力；（3）磁力不受介質(zhì)表面電荷、離子強(qiáng)度和pH值的影響。然而，由于大多數(shù)細(xì)胞和顆粒不是磁性的，所以通常需要用免疫磁珠標(biāo)記細(xì)胞（或顆粒）。微觀結(jié)構(gòu)篩選通常用于被動(dòng)分揀。由于單元尺寸、形狀和可變形性的差異，該技術(shù)使用微機(jī)械技術(shù)在芯片上設(shè)計(jì)不同尺寸的孔、柱、溝、壩和其他微結(jié)構(gòu)，而無需增加外力。主要分為薄膜式、微柱式和圍堰式。微結(jié)構(gòu)分離原理簡(jiǎn)單，通過合理設(shè)計(jì)精細(xì)結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)非常精確的顆粒分離，且該方法制造難度大、通量低、操作簡(jiǎn)單。DLD技術(shù)是Huang等人在2004年提出的一種新方法，用于根據(jù)粒徑等特性進(jìn)行連續(xù)選擇。該方法是一種基于粒度特征的高效、連續(xù)機(jī)械力分離方法。通過在流體通道中放置多個(gè)障礙物，當(dāng)顆粒直徑大于臨界值時(shí)，顆粒和微柱改變運(yùn)動(dòng)軌跡，導(dǎo)致碰撞后的偏移。當(dāng)粒徑小于或等于臨界值時(shí)，顆粒與微柱碰撞后不發(fā)生偏移，沿原流動(dòng)方向流動(dòng)，實(shí)現(xiàn)不同粒徑顆粒的分離。該方法已用于多種生物學(xué)目的，包括分選稀有細(xì)胞、濃縮循環(huán)腫瘤細(xì)胞、分離活細(xì)胞和死細(xì)胞、分離紅細(xì)胞和白細(xì)胞等。2007年，Di-Carlo等人首次將慣性聚焦技術(shù)應(yīng)用于微流控設(shè)備，通過研究了線性和彎曲微通道中的粒子聚焦，設(shè)計(jì)了對(duì)稱和非對(duì)稱正弦通道來實(shí)現(xiàn)粒子聚焦。從那時(shí)起，慣性微流體技術(shù)引起了人們的關(guān)注并得到了積極的發(fā)展。根據(jù)微通道的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，慣性微流控技術(shù)可分為三類。這三種慣性篩選方法具有固有的特點(diǎn)，適用于不同的應(yīng)用。此外，被動(dòng)分選方法包括水力分選、擠壓流分選、仿生分選、親和性分選等。（3）細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)成分復(fù)雜，細(xì)胞內(nèi)成分的分析和檢測(cè)有助于研究細(xì)胞代謝過程、細(xì)胞與藥物的相互作用以及細(xì)胞功能。細(xì)胞生物學(xué)、藥物篩選和環(huán)境監(jiān)測(cè)都很重要。微流控芯片技術(shù)為細(xì)胞檢測(cè)和分析提供了很好的技術(shù)平臺(tái)。根據(jù)檢測(cè)原理的不同，微流控細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)可分為電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)和光學(xué)檢測(cè)技術(shù)。電化學(xué)檢測(cè)方法是將電極或傳感器安裝在芯片上，通過在分析溶液中記錄被測(cè)物體的化學(xué)反應(yīng)引起的電阻、容量、電流和電壓的變化來反映物體的信息。該方法簡(jiǎn)單、成本低、易于集成。更重要的是，它具有高靈敏度和實(shí)時(shí)性。這是目前使用的檢測(cè)方法之一。光檢測(cè)是一種通過檢測(cè)不同參數(shù)來確定生化樣品指數(shù)的方法。它具有檢測(cè)精度高、與樣品接觸、設(shè)備簡(jiǎn)單、易于與微流控芯片集成等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用最廣泛的微流控芯片信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)。1993年，伯恩斯報(bào)道了用激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)檢測(cè)懸浮液滴中的單分子。熒光檢測(cè)是最靈敏的檢測(cè)技術(shù)之一。目前，熒光檢測(cè)極限從微微摩爾上升到1升納米孔。熒光檢測(cè)技術(shù)存在固有缺陷。也就是說，在分析之前，必須對(duì)非熒光分析物進(jìn)行熒光標(biāo)記。圖像包含許多信息，如細(xì)胞大小、形狀和表面形態(tài)。因此，結(jié)合圖像信息的細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)備受關(guān)注。例如，新興的成像流式細(xì)胞儀集成了傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的顯微細(xì)胞分析方法的單細(xì)胞識(shí)別、高通量、快速分析和圖像數(shù)據(jù)采集?？梢詫?duì)細(xì)胞的形態(tài)特征和光電特性進(jìn)行完整的分析，并且可以快速準(zhǔn)確地分析復(fù)雜的細(xì)胞群體。然而，成像流式細(xì)胞術(shù)具有價(jià)格高、操作復(fù)雜、體積大等缺點(diǎn)，限制了其在許多要求小型化、現(xiàn)場(chǎng)化、低成本等領(lǐng)域的應(yīng)用。2.2微流控芯片技術(shù)的發(fā)展歷程微流控芯片實(shí)驗(yàn)室首次出現(xiàn)在20世紀(jì)90年代初。Manz和Widner首次提出了微型全分析系統(tǒng)（itas）的概念，微流控技術(shù)是由微流控技術(shù)發(fā)展而來的。后來，與微流控芯片相關(guān)的公司相繼出現(xiàn)。隨著基于微流控芯片的高質(zhì)量文章的增多，微流控芯片技術(shù)越來越受到科學(xué)界和人們的關(guān)注。微流控技術(shù)被評(píng)為影響人類未來的十五項(xiàng)最重要發(fā)明之一。自微流控芯片技術(shù)問世以來，人們對(duì)其的研究一直沒有停止過。目前，人類仍在進(jìn)行這方面的努力和研究。微流控芯片可以與微流控、生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)、計(jì)算機(jī)、材料科學(xué)等多個(gè)技術(shù)領(lǐng)域相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)各種分析檢測(cè)功能，采樣、稀釋、試劑添加、反應(yīng)、分離，最大限度地將檢測(cè)等分析功能集成到最大的集成分析系統(tǒng)中。微流控芯片技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，使許多檢測(cè)設(shè)備和醫(yī)療設(shè)備小型化、便攜化，給人們的生活帶來了極大的便利。只有在特定地點(diǎn)才能完成的功能可以隨時(shí)隨地實(shí)現(xiàn)?？偟膩碚f，微流控芯片技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）檢測(cè)速度快，分析效率高。為了在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)相關(guān)的自動(dòng)分析和檢測(cè)功能，只需幾秒鐘或更短的時(shí)間。（2）樣品和試劑消耗低。由于微流控芯片中的通道尺寸為微納級(jí)，因此所需的檢測(cè)樣品和相關(guān)生物試劑可以是微升或納升。對(duì)于昂貴的生物試劑，可以大大節(jié)省檢測(cè)成本，并且可以在樣本很少的情況下檢測(cè)。（3）體積小型化，易于集成和攜帶。由于生化分析實(shí)驗(yàn)室集中在一個(gè)不到幾平方厘米的芯片上，它可以通過收集、處理和顯示信號(hào)作為便攜式檢測(cè)器，用于各種現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和分析，如極端環(huán)境和條件，如偏遠(yuǎn)地區(qū)、戰(zhàn)爭(zhēng)和外空間。2.3微流控芯片的微藻檢測(cè)技術(shù)微流控芯片是一種用于微納通道樣品自動(dòng)生化分析的新技術(shù)，為生化分析提供了良好的微環(huán)境平臺(tái)。微流控芯片實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞研究和分析。它具有樣品體積小、速度快、成本低、小型化等優(yōu)點(diǎn)。高水平自動(dòng)檢測(cè)，測(cè)量誤差小，現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，成本低，檢測(cè)器小型化、集成化，可批量生產(chǎn)。這些潛在優(yōu)勢(shì)在其他技術(shù)中是不存在的。微流控芯片分析技術(shù)是化學(xué)和生物分析的重要工具。它的優(yōu)點(diǎn)（低消耗、原位分析、高速實(shí)時(shí)等）被應(yīng)用于細(xì)胞和分子水平的檢測(cè)，尤其是在細(xì)胞研究和應(yīng)用中。微通道尺度與細(xì)胞親和力強(qiáng)，在體內(nèi)模擬能力強(qiáng)，在生命科學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞操作、樣品處理和細(xì)胞檢測(cè)。它成為實(shí)時(shí)發(fā)現(xiàn)和研究細(xì)胞和單細(xì)胞的新平臺(tái)。微流控芯片上的細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)主要采用光電檢測(cè)和電化學(xué)檢測(cè)。光檢測(cè)是一種靈敏、簡(jiǎn)單的設(shè)備，易于與微流控芯片結(jié)合。它具有實(shí)時(shí)檢測(cè)活細(xì)胞的巨大潛力。微流控芯片在船舶壓載水中微藻的檢測(cè)、鑒定和分類中引起了研究人員的關(guān)注。這些研究成果在這一領(lǐng)域有著優(yōu)異的表現(xiàn)，出現(xiàn)了許多新的快速識(shí)別方法。基于微流控芯片的微藻識(shí)別、鑒定和分類主要有靜態(tài)成像法、動(dòng)態(tài)法、光譜法、阻抗法和光波導(dǎo)形狀識(shí)別法。阻抗檢測(cè)是一種常用的電子檢測(cè)方法。直流阻抗測(cè)量比傳統(tǒng)交流儀器簡(jiǎn)單。與光譜檢測(cè)相比，阻抗檢測(cè)鑒別和識(shí)別細(xì)胞大小和計(jì)數(shù)細(xì)胞。然而，當(dāng)檢測(cè)樣本是多個(gè)不同的粒子或細(xì)胞時(shí)，它不能像光學(xué)檢測(cè)那樣提供許多粒子信息?；谖⒘骺匦酒墓鈱W(xué)探測(cè)鑒別法是一種比較準(zhǔn)確的微藻鑒定方法。微藻有各種大小、形狀和結(jié)構(gòu)，包括各種色素和輔助色素。這些內(nèi)部探針為微藻的光學(xué)識(shí)別提供了標(biāo)準(zhǔn)。將光纖埋入微流控芯片中檢測(cè)葉綠素、藻紅蛋白和微藻散射光。使用波分復(fù)用光纖耦合器將兩個(gè)激光器的泵浦光耦合到嵌入微流控芯片的單模光纖上。兩條多模光纖以90度角排列，用于激發(fā)光纖，用于收集熒光和散射光。光纖采集的光信號(hào)通過光學(xué)帶通濾波器直接入射到光電倍增管上，并通過測(cè)量的光學(xué)信息檢測(cè)和識(shí)別微藻。然而，在芯片中嵌入光纖集成是很困難的。Schaap等人利用嵌入石英制芯片的光纖，觀察微小藻類通過檢測(cè)點(diǎn)產(chǎn)生的小波變化，并判斷其形狀。然而，在上述方法中，電極和光纖集成在芯片中，并且處理困難且成本高?；谖⒘骺匦酒奈⒃遄R(shí)別方法和設(shè)備中的微藻識(shí)別方法和設(shè)備在微流控芯片中積累并嵌入光纖。將光纖嵌入微流控芯片有兩個(gè)主要原因。其中一個(gè)原因是光纖靠近細(xì)胞距離，這大大提高了激發(fā)光激發(fā)效率和發(fā)射的葉綠素?zé)晒獾氖占?。另一個(gè)原因是，測(cè)量前的散射光（FSC）通常用于測(cè)量細(xì)胞的大小，而嵌入式光纖大大提高了散射光的檢測(cè)精度。雖然這些方法具有高度的靈敏度，但與分離光學(xué)布局相比，存在一些缺點(diǎn)，例如成本高、處理過程復(fù)雜和穩(wěn)定性差。3微流控芯片在船舶壓載水檢測(cè)中的應(yīng)用3.1微流控芯片技術(shù)檢測(cè)船舶壓載水中藻細(xì)胞活性的研究3.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（1）實(shí)驗(yàn)原理在本實(shí)驗(yàn)中，通過檢測(cè)單個(gè)微藻細(xì)胞的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度來表征單個(gè)微藻細(xì)胞的活性。檢測(cè)原理是激光誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒饫碚?。微藻?xì)胞中含有多種色素，葉綠素就是其中之一。葉綠素是光合作用過程中最重要的載體，包括葉綠素a、葉綠素b、葉綠素C和類胡蘿卜素。微藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素具有熒光特性，葉綠素會(huì)發(fā)出特定的波長(zhǎng)和強(qiáng)度。這是因?yàn)樵诳梢姽庹丈湎?，葉綠素分子在高能下從最穩(wěn)定的基態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴环€(wěn)定的激發(fā)態(tài)。由于激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，電子容易從激發(fā)態(tài)躍遷到原始基態(tài)，電子躍遷過程伴隨著能量的釋放。當(dāng)電子從第二激發(fā)態(tài)躍遷到第一激發(fā)態(tài)時(shí)，能量通常以熱輻射的形式釋放到外部。當(dāng)電子進(jìn)一步從第一激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)時(shí)，能量以特定波長(zhǎng)的光的形式向外發(fā)射。這是熒光的產(chǎn)生機(jī)制。通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度，可以表征微藻細(xì)胞的葉綠素含量，以及微藻細(xì)胞的活性。葉綠素選擇性地吸收光。也就是說，當(dāng)具有不同波長(zhǎng)和強(qiáng)度的光被葉綠素照射時(shí)，光以不同的強(qiáng)度和波長(zhǎng)受到刺激。葉綠素只吸收可見光中的紅光和藍(lán)光。葉綠素a和葉綠素b的藍(lán)光吸收波長(zhǎng)為400～500nm，紅光吸收波長(zhǎng)為640～680nm。圖3.1顯示了葉綠素a的激發(fā)和發(fā)射光譜。圖3.1葉綠素a的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜示意圖從圖3.1可以看出，在450nm到500nm之間，光的吸收最大，也就是說，葉綠素a在該波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)激發(fā)光最敏感。激發(fā)后的發(fā)射波長(zhǎng)集中在640nm到700nm之間。這種光叫做葉綠素?zé)晒狻＜ぐl(fā)后的激發(fā)光用中心波長(zhǎng)685nm的濾光片過濾，光電設(shè)備接收并轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的信號(hào)數(shù)據(jù)。葉綠素?zé)晒鈾z測(cè)原理如圖3.2所示。圖3.2葉綠素?zé)晒鈾z測(cè)原理圖（2）系統(tǒng)組成檢測(cè)系統(tǒng)主要由激光器、微流控芯片、光電倍增管、直流電源、數(shù)據(jù)采集設(shè)備、PC機(jī)和注射泵組成。圖3.3示出了檢測(cè)系統(tǒng)的框圖。圖3.3檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)框圖光電倍增管是探測(cè)系統(tǒng)的核心部件。光電倍增管由光電陰極、電子光學(xué)輸入系統(tǒng)、二次輻射倍增系統(tǒng)和陽(yáng)極組成。具體加工工藝如下：外部光子影響光電陰極產(chǎn)生光電子。光電子通過內(nèi)部電壓的作用進(jìn)入倍增系統(tǒng)。經(jīng)過多級(jí)倍增后，電子聚集在陽(yáng)極中產(chǎn)生電壓或電流。通過檢測(cè)電壓或電流，可以從外部評(píng)估入射到光電倍增管上的光子數(shù)量，即從光的強(qiáng)度。光電倍增管的工作原理如圖3.4所示。圖3.4光電倍增管工作原理圖由于實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的熒光很弱，光電倍增管需要一個(gè)密封的檢測(cè)環(huán)境，因此研究了三維密封模型，并將繪圖結(jié)構(gòu)圖帶入3D打印機(jī)，選擇了屏蔽性能好的黑色材料。密封結(jié)構(gòu)完成后，密封檢測(cè)部分，密封檢測(cè)部分如圖3.5所示。圖3.5密封后的檢測(cè)部件實(shí)物圖檢測(cè)系統(tǒng)的激發(fā)光源采用單頻發(fā)射方向性好的藍(lán)光激光。濾光片采用紅光濾光片，濾光片中心波長(zhǎng)為685nm。電源采用直流可調(diào)電源，為光電倍增管提供持續(xù)穩(wěn)定的電壓。數(shù)據(jù)采集設(shè)備采用NIUSB-6259采集板，該采集板對(duì)光電倍增管轉(zhuǎn)換的電壓信號(hào)進(jìn)行濾波和放大，并將其發(fā)送至計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析。計(jì)算機(jī)有特殊的虛擬儀器程序和相關(guān)的硬件驅(qū)動(dòng)程序。加載到計(jì)算機(jī)上的數(shù)據(jù)讀寫程序由LabVIEW語(yǔ)言設(shè)計(jì)，LabVIEW語(yǔ)言具有多個(gè)功能庫(kù)、子VI、控制包等，可以對(duì)每個(gè)子功能和程序進(jìn)行調(diào)節(jié)。由于來自光電倍增管端子的電子數(shù)量等于相應(yīng)脈沖序列的數(shù)量，因此只要對(duì)脈沖序列的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，就可以知道產(chǎn)生的電子數(shù)量。程序?qū)γ棵氩杉拿}沖序列進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算值確定為一個(gè)點(diǎn)。確定好一個(gè)點(diǎn)后再確定下一個(gè)點(diǎn)。確定兩個(gè)點(diǎn)后，將它們連接到曲線并連接到其他點(diǎn)。最后，讀取信號(hào)曲線顯示在程序窗口上。數(shù)據(jù)顯示程序的控制布局如圖3.6所示。在圖中，“指示燈”控件用于表示程序的運(yùn)行狀態(tài)，指示綠燈正在運(yùn)行程序。啟動(dòng)控件用于啟動(dòng)程序。停止控制用于終止程序，當(dāng)前時(shí)間頻率（CPS）顯示在“當(dāng)前計(jì)數(shù)”控制中?！翱傆?jì)數(shù)”控件顯示的值是從檢測(cè)開始到當(dāng)前時(shí)間的計(jì)數(shù)數(shù)，“檢測(cè)時(shí)間”控件以秒為單位顯示程序的總執(zhí)行時(shí)間。圖3.6數(shù)據(jù)顯示程序的控件布局圖3.1.2實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法（1）處理試剤的制備在本實(shí)驗(yàn)中，微波藻類的處理試劑是次氯酸鈉消毒劑，因?yàn)榛瘜W(xué)方法在目前處理船舶壓載水中的微藻時(shí)更有效。次氯酸鈉溶液是一種常見的消毒劑，可產(chǎn)生1-15%的氯，易于制造。有效氯溶液的強(qiáng)氧化可以攻擊和殺死壓載水中的藻類。它是常用的化學(xué)試劑，廣泛用于殺滅微生物。用碘量法測(cè)定次氯酸鈉溶液中次氯酸鈉的濃度。碘量法的原理是次氯酸鈉消毒劑中的有效氯在酸性溶液中與碘化鉀反應(yīng)，碘的量是通過氧化釋放的。用已知濃度的硫代硫酸鈉滴定硫代硫酸鈉，可根據(jù)硫代硫酸鈉的消耗量得出次氯酸鈉消毒劑中有效氯的含量。本實(shí)驗(yàn)中碘測(cè)量值的測(cè)定如下。1）試劑的配制①10%碘化鉀溶液②向0.5g淀粉中加入5%淀粉溶液，放入燒杯中，向燒杯中倒入100ml熱水，繼續(xù)攪拌，直到溶液變透明。③2mol/LH2SO4溶液；④0.1mol/LK2Cr2O7溶液，干燥的K2Cr2O7試劑首先在室溫下儲(chǔ)存在干燥容器中2小時(shí)。然后，在天平中稱取1.2258g的k22cr2o7試劑，放入燒杯中，用去離子水在250ml容量瓶中完全溶解，用水稀釋，搖勻。⑤0.1mol/lNa2S2O3溶液，12.5gNa2S2O35H2O，在500ml去離子水中稱重，添加0.1g碳酸鈉，完全溶解，并儲(chǔ)存在棕色瓶中。2）有效氯的測(cè)定將10mL次氯酸鈉水溶液放入帶進(jìn)樣管的錐形瓶中，依次加入10mL硫酸溶液（2mol/L）和10mL碘化鉀溶液（10%）。溶液的顏色是棕色。蓋上碘酒瓶，搖勻。在瓶蓋邊緣加入幾滴清蒸填充水，并倒入5分鐘。然后用Na2S2O3溶液滴定游離碘，滴水時(shí)搖勻。當(dāng)瓶子的溶液變?yōu)闇\棕黃色時(shí)，淀粉指示劑（0.5%）下降，溶液變?yōu)樗{(lán)色。繼續(xù)傾倒，直到溶液變?yōu)闊o色。記錄測(cè)量過程中消耗的Na2S2O3溶液的體積。為確保測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性，相同的測(cè)量過程重復(fù)三次，并對(duì)以下計(jì)算進(jìn)行平均。C=c*v*0.03545/W*100%測(cè)量次氯酸鈉消毒劑中的有效氯含量后，可以知道次氯酸鈉的含量，并用純水稀釋以提供必要的濃度。使用次氯酸鈉溶液（3x104ppm）、次氯酸鈉溶液（30ppm）和福爾馬林（37%至40%甲醛溶液）直觀地比較了不同處理劑對(duì)微藻活性動(dòng)力學(xué)變化的影響。（3）單微藻細(xì)胞活性監(jiān)測(cè)光電倍增管（PMT）非常靈敏，探測(cè)范圍被限制在探測(cè)極限內(nèi)。因此，必須嚴(yán)格控制PMT上的光照強(qiáng)度，以防止損壞設(shè)備。單個(gè)微藻細(xì)胞的葉綠素?zé)晒夥浅Ｐ?。為了弄清單個(gè)微藻細(xì)胞的活性變化，必須嚴(yán)格控制激發(fā)強(qiáng)度、濾池的滲透面積和周圍環(huán)境。此外，應(yīng)在每次實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行背景測(cè)試，以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和有效性。經(jīng)過多次調(diào)試，選擇封閉暗室作為實(shí)驗(yàn)環(huán)境，選擇488nm波長(zhǎng)的單藍(lán)光作為激發(fā)光源，光源功率為1.0mW。濾光片的中心波長(zhǎng)為685nm。直流電源的輸出值保持在4.85-5.00V之間，接口連接到光電倍增管的電源線。連接檢測(cè)系統(tǒng)后，可以調(diào)整激光源、微流控芯片和紅光濾光片之間的相對(duì)位置，激光可以準(zhǔn)確擊中微藻細(xì)胞，并注意濾光片狹縫的大小，確保良好的信噪比。安裝檢測(cè)系統(tǒng)后，首先運(yùn)行后臺(tái)測(cè)試。本底測(cè)試的目的是測(cè)試系統(tǒng)的穩(wěn)定性。本底測(cè)試時(shí)間為幾分鐘。如果測(cè)試界面上的檢測(cè)線近似為直線，如圖3.7所示，則檢測(cè)系統(tǒng)穩(wěn)定。圖3.7系統(tǒng)本底測(cè)試圖本底測(cè)試完成后，首先將微流控芯片準(zhǔn)確捕捉到系統(tǒng)的檢測(cè)位置，關(guān)閉暗室周圍的所有光源，然后打開軟件操作界面，點(diǎn)擊開始按鈕，最后打開PMT開關(guān)，檢測(cè)未經(jīng)處理的單個(gè)微藻細(xì)胞的活動(dòng)。時(shí)間測(cè)試完成后，關(guān)閉PMT，點(diǎn)擊軟件界面上的停止按鈕，保存測(cè)量的信號(hào)數(shù)據(jù)。然后，再次關(guān)閉暗室周圍的所有光源，然后單擊開始按鈕，從微流控芯片的注射孔中滴下10uL的處理試劑，并使用數(shù)字移液槍打開PMT開關(guān)，以快速監(jiān)測(cè)處理后的單個(gè)微藻細(xì)胞活性。再次監(jiān)控時(shí)間后，點(diǎn)擊軟件界面上的停止按鈕，在PMT開關(guān)關(guān)閉時(shí)保存測(cè)量的信號(hào)數(shù)據(jù)。保存數(shù)據(jù)后，微通道中捕獲的單個(gè)微藻完全死亡，等待一段時(shí)間再次關(guān)閉暗室周圍的所有光源，然后打開軟件操作界面并單擊開始按鈕。為了獲得相應(yīng)的基準(zhǔn)值，打開PMT開關(guān)以檢測(cè)單個(gè)死亡微藻細(xì)胞的熒光。測(cè)量完成后，關(guān)閉PMT開關(guān)，點(diǎn)擊軟件界面上的停止按鈕，存儲(chǔ)測(cè)量的信號(hào)數(shù)據(jù)。3.1.3結(jié)果與討論（1）不同處理試劑對(duì)同種單微藻細(xì)胞處理后活性變化根據(jù)設(shè)定的實(shí)驗(yàn)方案，監(jiān)測(cè)了不同處理劑處理后，單亞種渦蟲活性的動(dòng)態(tài)變化。圖3.8顯示了用30ppm次氯酸鈉溶液處理后單中心扁藻的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度隨時(shí)間的變化。在圖中，橫軸代表時(shí)間，縱軸代表單位時(shí)間的PMT收集的單個(gè)光子數(shù)，縱軸是微藻細(xì)胞葉綠素?zé)晒獾奶卣髦?，符合光電倍增管的原理。類似地，圖3.9顯示了在處理濃度為3X104ppm的次氯酸鈉溶液后處理單個(gè)中心扁平藻后，扁平藻單個(gè)中心部分的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度的變化。圖3.10顯示了福爾馬林（37%至40%甲醛溶液）處理后單個(gè)心下扁平藻的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度隨時(shí)間的變化。（a）處理前（b）處理中（c）處理后圖3.830ppm的次氯酸鈉處理后單個(gè)亞心型扁藻的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度變化（a）處理前（b）處理中（c）處理后圖3.93X104ppm的次氯酸鈉處理后單個(gè)亞心型扁藻的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度變化（a）處理前（b）處理中（c）處理后圖3.10福爾馬林(37%~40%的甲醛溶液)處理后單個(gè)亞心型扁藻的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度變化當(dāng)單個(gè)亞心型扁藻細(xì)胞的活性沒有發(fā)生根本性變化，而單個(gè)皮層下扁平藻細(xì)胞未經(jīng)處理，而是經(jīng)化學(xué)試劑處理，且其活性隨時(shí)間呈下降趨勢(shì)時(shí)，其活性立即受到影響。然而，通過對(duì)單中心扁平藻細(xì)胞活性的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)微藻細(xì)胞的活性并不總是被抑制，其活性的減弱是一個(gè)劇烈的下降過程。如圖3.11所示，本文獲得的單個(gè)亞心型扁藻細(xì)胞的活性動(dòng)態(tài)變化曲線可以清晰地觀察到活性變化過程。圖3.11單個(gè)亞心型扁藻的活性動(dòng)態(tài)變化曲線在圖3.11中，使用濃度為30ppm的次氯酸鈉溶液、濃度為3X104ppm的次氯酸鈉溶液、福爾馬林（37%至40%甲醛溶液）作為治療試劑，用于治療單個(gè)亞心型扁藻細(xì)胞。橫坐標(biāo)代表時(shí)間s，縱軸代表相對(duì)活動(dòng)，代表單個(gè)心臟下扁平藻類細(xì)胞活動(dòng)的相對(duì)變化。通過取活性的相對(duì)變化值，可以消除單個(gè)心臟下扁平藻細(xì)胞活性背景值和絕對(duì)值差異的影響，直觀比較單個(gè)心臟下扁平藻細(xì)胞的活性變化曲線。從圖中可以看出，不同的加工試劑對(duì)單個(gè)心臟扁平藻細(xì)胞的活性變化有不同的影響。3x104ppm濃度的次氯酸鈉溶液的處理效果遠(yuǎn)強(qiáng)于30ppm濃度的次氯酸鈉溶液和福爾馬林（37%至40%甲醛溶液）。濃度為30ppm的次氯酸鈉溶液的處理效果與福爾馬林（37%至40%甲醛溶液）的處理效果差別不大。兩者都能在5分鐘內(nèi)完全殺死亞中心扁平藻細(xì)胞。從亞心型扁藻的活性動(dòng)態(tài)變化曲線可以看出，扁藻細(xì)胞的活性變化不是單調(diào)的，扁藻細(xì)胞的生理特性（抗逆性等）在藥劑處理過程中起著拮抗作用。另外，從圖中可以看出，三種試劑都可在30s使扁藻細(xì)胞的相對(duì)活性降至0.5以下，這說明這三種處理試劑均可在30s內(nèi)有效處理扁藻這種生物。在圖3.11中，擬合曲線顯示了用濃度為3X104ppm的次氯酸鈉溶液處理之前，亞心型扁藻細(xì)胞（50-60）的活性變化。這是一種常規(guī)的檢測(cè)方法，即在每個(gè)時(shí)期檢測(cè)藻類細(xì)胞的活性，并分析治療效果。為了簡(jiǎn)化比較，數(shù)據(jù)的多項(xiàng)式擬合和擬合方程的決策系數(shù)均為0.95616，擬合度很好。對(duì)比分析表明，常規(guī)檢測(cè)菌落藻細(xì)胞可以產(chǎn)生略微單調(diào)的下降曲線。統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以涵蓋單個(gè)藻類細(xì)胞之間的差異，以及許多有價(jià)值的信息方法。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，這是檢測(cè)方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。（2）不同種類的單微藻細(xì)胞用同種試劑處理后活性變化為了比較同一化學(xué)試劑處理后不同藻類活性的動(dòng)態(tài)變化，用濃度為30ppm的次氯酸鈉溶液處理捕獲的單個(gè)亞心型扁藻細(xì)胞和單個(gè)杜氏鹽藻細(xì)胞。根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，監(jiān)測(cè)單個(gè)震源藻類細(xì)胞和單個(gè)鹽藻細(xì)胞活性的動(dòng)態(tài)變化。圖3.12顯示了在濃度為30ppm的次氯酸鈉溶液中處理單個(gè)鹽藻后，單個(gè)鹽藻葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度的變化。橫坐標(biāo)表示時(shí)間s，縱坐標(biāo)表示單位時(shí)間內(nèi)PMT收集的單光子數(shù)。根據(jù)上述光電倍增管，縱坐標(biāo)代表微藻細(xì)胞的葉綠素?zé)晒馓卣髦?。圖3.1230ppm的次氯酸鈉處理后單個(gè)杜氏鹽藻的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度變化這些結(jié)果表明，單個(gè)鹽藻細(xì)胞的活性不受單個(gè)鹽藻細(xì)胞的影響。同樣，通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)單個(gè)鹽藻細(xì)胞的活性，發(fā)現(xiàn)鹽藻細(xì)胞的活性并不總是被抑制，其活性的減弱也是一個(gè)嚴(yán)重的下降過程。圖3.13顯示了用30ppm濃度的次氯酸鹽溶液處理后單個(gè)杜氏鹽藻和單個(gè)亞心型扁藻的活性動(dòng)態(tài)變化曲線。圖3.13單個(gè)柱氏鹽藻與單個(gè)亞心型扁藻的活性動(dòng)態(tài)變化曲線從圖3.13可以看出，兩個(gè)微藻細(xì)胞的生理特性（如抗逆性）在試劑處理過程中不難發(fā)揮拮抗作用。亞心型扁藻的拮抗作用在60年代、220年代和260年代更為明顯，杜氏鹽藻的拮抗作用比60年代、200年代和240年代更為明顯。此外，在相同的化學(xué)試劑（30ppm濃度的次氯酸鹽溶液）處理5分鐘后，亞心型扁藻細(xì)胞的相對(duì)活性降低至0，而鹽藻細(xì)胞的相對(duì)活性繼續(xù)保持，表明亞心型扁藻細(xì)胞死亡。大于0.1表明鹽藻細(xì)胞沒有死亡。30℃處理未經(jīng)處理的扁平藻細(xì)胞后，30ppm次氯酸鈉溶液的相對(duì)活性為0。下降到5。這表明杜氏鹽藻的拮抗作用強(qiáng)于亞中心扁平藻。也就是說，在實(shí)際的海灘水處理過程中，杜氏鹽藻比亞中心扁平藻更難處理。杜氏鹽藻細(xì)胞的活性在50s至175s期間顯著降低，而杜氏鹽藻的拮抗作用在這段時(shí)間內(nèi)最弱，這對(duì)實(shí)際船舶壓載水處理中的藥物控制和用藥時(shí)間具有重要意義。3.2微流控芯片技術(shù)檢測(cè)船舶壓載水中藻細(xì)胞計(jì)數(shù)的研究3.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)主要由激發(fā)光源、微流控芯片及平臺(tái)、激光誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒夤鈱W(xué)系統(tǒng)、RPS差分放大檢測(cè)電路、光電信號(hào)放大電路和數(shù)據(jù)采集模塊組成。葉綠素?zé)晒鈾z測(cè)計(jì)數(shù)系統(tǒng)如圖3.14所示。圖3.14葉綠素?zé)晒鈾z測(cè)計(jì)數(shù)系統(tǒng)原理示意圖本系統(tǒng)中的激光誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒鈾z測(cè)系統(tǒng)包括一個(gè)488nm的激光發(fā)射激光器，擊中芯片內(nèi)的RPS阻抗脈沖檢測(cè)區(qū)域，以確保激光發(fā)射激光器、RPS阻抗脈沖檢測(cè)區(qū)域和光電探測(cè)器位于同一平面。本系統(tǒng)中的RPS差分放大檢測(cè)電路用于檢測(cè)微藻顆粒的阻抗脈沖檢測(cè)信號(hào)，檢測(cè)原理是檢測(cè)微藻顆粒通過阻抗脈沖檢測(cè)區(qū)域時(shí)，檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的阻抗變化。（1）差分微流控芯片的設(shè)計(jì)芯片設(shè)計(jì)是微藻RPS檢測(cè)和計(jì)數(shù)的基礎(chǔ)。為了達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，芯片應(yīng)滿足以下要求：1）利用電泳原理，檢測(cè)區(qū)域順利通過，確保了葉綠素?zé)晒夂蚏PS檢測(cè)過程的連續(xù)性；2）適當(dāng)?shù)木劢雇ǖ缹挾冉窃试S樣品通過RPS和熒光檢測(cè)點(diǎn)的中心聚焦；3）適當(dāng)?shù)闹魍ǖ缹挾龋员３诌m當(dāng)?shù)牧髁浚?）RPS檢測(cè)區(qū)域的位置和大小滿足激光誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒夂蚏PS阻抗脈沖傳感的同時(shí)檢測(cè)。RPS檢測(cè)區(qū)域需要確保相對(duì)較小的細(xì)胞、最大藻細(xì)胞和高信噪比通過。芯片通道由叉型聚焦微通道、RPS檢測(cè)通道、RPS阻抗脈沖檢測(cè)區(qū)域和六個(gè)儲(chǔ)液池組成。利用AutoCAD二維繪圖軟件設(shè)計(jì)了微通道的結(jié)構(gòu)。圖形被轉(zhuǎn)換并存儲(chǔ)在特定的圖形文件中，并打印在具有高分辨率打印機(jī)的透明塑料膜上，以完成光刻掩模的生產(chǎn)。通道的整體水平長(zhǎng)度約為4cm，從樣品池到交叉點(diǎn)的寬度為100μm。寬度至5cm，RPS檢測(cè)區(qū)域和廢物箱μRPS阻抗脈沖檢測(cè)區(qū)域的檢測(cè)尺寸為35μM，寬度為15μM，RPS檢測(cè)通道2是聚焦通道粒子的RPS信號(hào)，寬度為100μM，微藻顆粒集中在主通道的中心線上。圖3.15RPS微流控芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)圖（2）差分放大檢測(cè)電路RPS差分放大檢測(cè)電路中使用的差分芯片是AD8210芯片。AD8210是一種低成本、高精度的儀表放大器，即精密差分電壓放大器。AD8210只需外部電阻即可設(shè)置增益。放大倍數(shù)為1到1000。在精度方面，放大到500倍時(shí)最為精確。高精度（最大非線性40ppm）和低偏移電壓μ5μ低偏移漂移是具有V/C特性的精密數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的理想選擇。AD8210具有低噪聲、低輸入偏置電流、低功耗特性，并具有電壓保護(hù)功能。此外，AD8210采用8引腳SOIC和DIP封裝，DIP封裝比分體式設(shè)計(jì)小，功耗低（最大電源電流為1.3mA）。它非常適合電池供電的便攜式（或遠(yuǎn)程）應(yīng)用。表3.1AD8210芯片的電氣特性參數(shù)額定值電源電壓±18V內(nèi)部功耗650mW輸入電壓（共模）±VS差分輸入電壓25V工作溫度范圍-55℃至+125℃引腳穩(wěn)定范圍（10s焊接）300℃RPS檢測(cè)電路是基于AD8210設(shè)計(jì)的差分放大電路。作為一種放大電路，AD8210具有良好的共模抑制、降低噪聲和增強(qiáng)檢測(cè)穩(wěn)定性。如圖3.16所示，根據(jù)AD8210的相關(guān)電路數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)了特定的RPS電路。圖3.16檢測(cè)電路原理圖電路圖中的電容器C3、C4和C5旨在抵抗射頻干擾。在該電路中，電容器C1和C2使用R2和R3放電。在放大器的輸入端設(shè)計(jì)R-C網(wǎng)絡(luò)，過濾射頻信號(hào)，過濾射頻干擾，保護(hù)放大器。在電路中，由于AD8210的輸出電壓與參考引腳的電勢(shì)有關(guān)，因此只有五個(gè)引腳必須接地才能解決問題。P3是差分信號(hào)的輸入，連接到RPS檢測(cè)到的兩個(gè)臂。P1是滑動(dòng)變阻器，輸入電壓進(jìn)入AD8210，選擇增益，并根據(jù)以下方程式計(jì)算RP1：RP1=49.4KΩ/G-1當(dāng)RP1=500Ω，放大率約為100。圖3.17是電路PCB焊接的物理圖。該電路體積小，易于集成到便攜式設(shè)備中，檢測(cè)精度與商用設(shè)備相近。圖3.17RPS差分放大電路（3）實(shí)驗(yàn)操作流程在實(shí)驗(yàn)過程中，首先將相當(dāng)于緩沖液的PBS緩沖液添加到樣品儲(chǔ)液池中。根據(jù)系統(tǒng)設(shè)計(jì)，將6個(gè)電極插入每個(gè)儲(chǔ)罐并連接到電路。在電滲流的驅(qū)動(dòng)下，樣品被輸送到主通道，流經(jīng)與緩沖池相連的通道，然后濃縮并通過RPS檢測(cè)區(qū)域。當(dāng)顆粒通過檢測(cè)區(qū)域時(shí)，與廢水池中的電極相連的濾波放大電路和差分放大器同時(shí)檢測(cè)葉綠素?zé)晒庑盘?hào)和變化后的微阻抗脈沖檢測(cè)信號(hào)，并將信號(hào)放大并將處理信號(hào)發(fā)送至NI信號(hào)采集卡。采集卡采集的數(shù)據(jù)由LabVIEW程序處理。3.2.2結(jié)果與討論對(duì)RPS檢測(cè)系統(tǒng)與8μm標(biāo)準(zhǔn)聚苯乙烯顆粒進(jìn)行了測(cè)試，測(cè)試結(jié)果如圖3.18所示。由于每個(gè)向下的峰值代表在檢測(cè)區(qū)域中流動(dòng)的顆粒，因此下峰值的數(shù)量是通過的顆粒數(shù)量，下峰值的大小可以代表顆粒的體積大小。圖3.188μm顆粒RPS檢測(cè)結(jié)果在RPS檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)粒子實(shí)驗(yàn)后，結(jié)合葉綠素?zé)晒鈾z測(cè)系統(tǒng)對(duì)微藻粒子樣品進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)微藻細(xì)胞的葉綠素?zé)晒?，根?jù)RPS阻抗脈沖傳感器對(duì)微藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并對(duì)細(xì)胞的大小和體積進(jìn)行粗略分析。通過葉綠素?zé)晒夂蚏PS阻抗脈沖可以自動(dòng)檢測(cè)微藻，并可以粗略分析微藻的數(shù)量和大小。該系統(tǒng)用于測(cè)試鹽藻細(xì)胞樣本，測(cè)試結(jié)果如圖3.19所示。圖3.19鹽藻細(xì)胞的葉綠素?zé)晒夂蚏PS