大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細(xì)胞-何久香課件

威斯騰生物技術(shù)中心大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細(xì)胞（一）大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)（二）腺病毒感染細(xì)胞（一）大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)1、實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備2、脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離3、脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備：實(shí)驗(yàn)器械的高壓滅菌新生鼠的購(gòu)買培養(yǎng)瓶的包被

（細(xì)胞培養(yǎng)前1-2h，培養(yǎng)瓶用0.1％多聚賴氨酸包被，置5％C02培養(yǎng)箱中，使用前用DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗干凈，吸盡所有多余的DMEM/F12培養(yǎng)基后備用于種板）脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離1、取新生乳鼠6只，75％乙醇皮膚消毒。無(wú)菌條件下剪刀斷頭，打開脊椎后取出脊髓組織并置于盛有DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中反復(fù)沖洗，盡可能洗掉可能附著的表面血細(xì)胞。2、使用眼科鑷細(xì)致的剝離皮層表面蛛網(wǎng)膜，并取出脊髓，在該過(guò)程中可適當(dāng)撕開軟脊膜組織一并去掉脊髓組織深面的血管，隨后使用冰預(yù)冷DMEM/F12反復(fù)沖洗。3．在玻璃培養(yǎng)皿中用眼科剪將脊髓組織剪碎致直徑0.3mm左右小塊，在剪碎過(guò)程中避免擠壓脊髓組織，加入無(wú)菌3ml0.25％胰酶，置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化30min至渾濁狀。4．加入2-3ml含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，靜置3min后先用吸管吸去多余液體，再用吸管輕輕地吹打3次，收集細(xì)胞懸液，經(jīng)200目的不銹鋼網(wǎng)濾過(guò)除去雜質(zhì)，過(guò)濾后的細(xì)胞懸液移入10ml無(wú)菌離心管中，然后800rpm離心7min。脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞換液對(duì)于貼壁細(xì)胞，首先應(yīng)先吸除培養(yǎng)瓶中舊培養(yǎng)基，用PBS洗2~3次，補(bǔ)加入新培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)。細(xì)胞傳代對(duì)于貼壁細(xì)胞，首先應(yīng)先吸除培養(yǎng)瓶中舊培養(yǎng)基，用PBS洗2~3次，50ml培養(yǎng)瓶加入胰酶消化液約1ml，晃動(dòng)使消化液鋪均勻，置37度培養(yǎng)箱約2-5分鐘，鏡下見細(xì)胞收縮變圓或少數(shù)脫落后，輕輕振動(dòng)瓶底使細(xì)胞全部脫落，加入2-3ml完全培養(yǎng)基后，輕輕吹打，收集細(xì)胞至離心管，1000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清，加培養(yǎng)液，輕輕吹打成細(xì)胞懸液，按照1：2或1：3的比例傳代至無(wú)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)。（二）腺病毒感染細(xì)胞確定腺病毒的最佳感染滴度腺病毒感染細(xì)胞確定腺病毒的最佳病毒滴度（96孔板）準(zhǔn)備細(xì)胞：8000～10000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板病毒稀釋：在離心管中用維持液將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，從10-1到10-7病毒感染：將稀釋好的病毒接種到96孔培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8孔，每孔接種100ul；設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照(兩縱排),只加維持液100ul。細(xì)胞培養(yǎng)：將培養(yǎng)板放置于CO2培養(yǎng)箱（37℃5%CO2），培養(yǎng)5-7天測(cè)定結(jié)果：取出培養(yǎng)板，顯微鏡下觀