分子雜交技術課件

ACGT分子雜交技術基因公司技術講座****分子雜交****分子生物學中用于檢測生物樣本中是否含有特定的生物分子（探針）的一門技術。分子雜交原理及流程圖樣品制備電泳雜交轉膜結果顯示探針制備***分子雜交分類***?SouthernBlotDNA雜交?NorthernBlotRNA雜交?WesternBlot蛋白質雜交?原位雜交****樣品制備****?DNA純化?RNA純化****探針制備****隨機引物法雙鏈DNA探針合成標記優(yōu)化技術DECAprimeTMIIRandomPrimingDNALabelingKit優(yōu)化技術：*高純度無外切酶活性的Klenow酶提高了標記效率10分鐘完成反應*改進的標記動力學增加了探針產量對低純度及低濃度模板也能通過延長反應時間達到目的*獨特的Decamer溶液提高引物-模板復合物穩(wěn)定性減少引物雙體形成，提高了靈敏度*標記靈活：提供dATP和dCTP兩種標記緩沖液特異性單鏈DNA探針合成標記優(yōu)化技術Prime-A-ProbeTMStrandSpecificDNAProbeSynthesisKit活性大于4×cpm/ug109合成高特異性全長RNA探針的最佳選擇——MAXIscriptTM體外轉錄試劑盒特點：*可合成長達2kb的RNA*產量可達2-4ug/ul同位素標記可達109cpm/ug*對應不同的啟動子有不同的試劑盒可供選擇*同位素或非放標記均可多次洗脫反復雜交探針制備技術——Strip-EZTMSystem專門為需要在同一張膜上反復標記檢測不同信號的用戶設計，提供非常溫和的雜交信號洗脫條件，提高膜的使用壽命達通常的三倍左右。工作原理合成探針的同時摻入經過修飾的dNTP(修飾不影響雜交特性）雜交檢測后將膜浸入探針降解緩沖液中將探針降解68℃溫和洗脫適用于：Northern\Southern\dot/slot及相關雜交Strip-EZTMRNA探針合成Strip-EZTMRNAProbeSynthesis&RemovalKit特點：*靈敏度高比隨機引物法DNA探針靈敏10倍以上*溫和洗脫，提高膜壽命*不同啟動子有不同試劑盒*同位素和非放標記均可效果比較PCR法Strip-EZTMDNA探針的合成Strip-EZTMPCRStripableDNAProbeSynthesis&RemovalKit

特點：*模板多樣：克隆序列、cDNA、PCR產物*不對稱PCR技術，產物大多為單鏈DNA探針*靈敏度高，比隨機引物法高3-5倍*提供除模板、標記物、Taq酶外所有合成探針及洗膜試劑，包括M13正反向及T7引物結果比較cDNAdsDNAssDNAssRNAOligonucleotidessRNAssDNAdsDNAOligonucleotideProbeType****標記類型****?放射性同位素標記：靈敏度高，成本低但操作不便，標記效率不太穩(wěn)定，壽命受半衰期限制?非放射性標記（地高辛、生物素、熒光素等）：安全，標記穩(wěn)定，探針壽命較長但靈敏度較低，背景較高，成本高非放射性雜交系統(tǒng)BrightStarTMPsoralen-BiotinNonisotopiclabelingKit&BioDetectTMNonisotopicDetectionKit靈敏度最高的非放檢測系統(tǒng)之一——BioDetectTMNonisotopicDetectionKit

采用的化學發(fā)光劑CDP-Star為發(fā)光最強、發(fā)光時間最長的化學發(fā)光底物之一，靈敏度與同位素相當。*曝光10-30分鐘相當于32P壓片1-2天*發(fā)光時間穩(wěn)定持續(xù)2天，發(fā)光峰值無明顯下降允許反復多次壓片*背景很低Phototope?化學發(fā)光系統(tǒng)NEBlot?Phototope?Kit&Phototope?-StarChemiluminescentDetectionKitNorthern雜交Southern雜交Phage文庫篩選菌落及質粒文庫篩選用途原位雜交及檢測試劑盒mRNAlocator-HybTMInSituHybridizationKitmRNAlocator-BiotinTMmRNAInSituDetectionKit6小時完成雜交RNasecure保證無RNase污染高效靈敏的NBT/BCIP-生物素探針顯色檢測提供對照改良的Northern雜交技術——Ambion公司的Northern雜交系列完整的Northern雜交試劑盒

包括從瓊脂糖、上樣、配膠、電泳、轉移緩沖液到雜交、洗膜液，除RNase、膜、Marker的全套試劑。簡便、無污染、背景低、分辨率高；同位素、非放標記均可雜交用瓊脂糖及聚丙烯酰氨凝膠——電泳膠專業(yè)廠家：BMA公司Agarose&PAGE預制膠Reliantgelsystem

ReliantRNAgelsystem

PAGErPrecastgelsNEB公司各種規(guī)格的優(yōu)質DNA/RNA/ProteinMWMarkersProteinMarker,BroadRange(2-212kDa)PrestainedProteinMarker,BroadRange(6-175kDa)HRPProteinMarkerDetectionPack世界標準雜交膜——Schleicher&Schuell公司產品*Protran?硝酸纖維素膜*Optitran?BA-S加強型硝酸纖維素膜*Nytran?尼龍膜*Nytran?SuPerCharge高負荷正電荷尼龍膜

單位面積所帶正電荷是普通膜的3倍大大降低了背景及非特異性結合膜孔徑、表面均一性、對稱毒度、潔凈度好分析基因差異表達的預制雜交膜熱點領域中基因的cDNA點陣各種來源的mRNACLONTECH公司的高效雜交液——ExpressHybHybridizationSolution特點：通過升高雜交溫度并使用修飾的雜交液不僅將雜交時間由傳統(tǒng)的12-24小時減為1-2小時，還大大降低了非放標記檢測的背景。特別適用于Northern雜交檢測低拷貝RNA和Southern雜交檢測單拷貝基因新型方便的除RNase試劑RNaseZAPRNaseDecontaminationSolution一種能完全去除玻璃、塑料表面RNase污染的噴霧劑ElectroZap

還可除電極及pH計等表面的RNaseRNAsecure

比傳統(tǒng)的DEPC使用安全、簡便無須滅菌等后續(xù)處理，不影響RT-PCR、體外轉錄等后續(xù)實驗RNAlater最方便的樣品貯藏液5倍體積即可抑制組織中的RNase穩(wěn)定的樣品可：室溫保存一周，4℃保存一月，-20℃長期保存不凍結樣品類型：組織（骨除外）、植物、大腸桿菌、果蠅、魚等分子雜交實驗所用部分儀器雜交箱