疾控中心培訓課件：《白喉的采樣及實驗室檢測技術》

白喉的采樣及實驗室檢測技術單/擊/此/處/添/加/副/標/題/內/容2020內容白喉病原學標本的采集與處理白喉病原菌檢測流程白喉的實驗室檢測技術白喉桿菌由白喉棒狀桿菌引起的急性呼吸道傳染病，屬于乙類傳染病，主要通過呼吸道飛沫或與感染病人接觸傳播。白喉棒狀桿菌棒狀桿菌屬，菌體細長，一端或兩端膨大呈棒狀，革蘭氏陽性，Neisser或Albert染色可見異染顆粒。主要致病物質是外毒素，可分為無毒白喉桿菌和產毒白喉桿菌脆弱，58℃，10min可滅活，對寒冷及干燥耐受性比較強，在分泌物中，尤其在陰暗處能存活1-3個月細菌性呼吸道傳染病感染機制鼻咽部定殖氣管吸入患者無癥狀攜帶者氣溶膠

鼻腔細菌黏附和穿透粘膜細菌血中生存細菌穿過血腦屏障樣品采集是實際檢測工作的起始樣品采集的適時性決定實際檢測結果的意義樣品采集的準確性決定實際檢測結果的可靠

樣本采集和處理“正確的微生物學檢驗始自正確的標本采取?！睒悠凡杉瓌t1.及時采集微生物標本作病原學檢查2.在抗菌藥物使用前采集標本3.采樣時嚴格執(zhí)行無菌操作4.采樣后立即送檢，甚至床旁接種5.棉拭子標本宜用運送培養(yǎng)基（白喉桿菌可用Amies或Stuart轉運培養(yǎng)基）6.混有正常菌群污染標本，不可置肉湯培養(yǎng)7.標本容器須滅菌處理，但不得使用消毒劑。標本的采集與處理咽拭子標本的采集與處理鼻咽拭子標本的采集與處理血液標本的采集與處理“假膜”標本采集痰液標本采集與處理咽拭子標本的采集與處理1.核對被采樣者，在操作區(qū)域點燃酒精燈。2.讓被采樣者張口發(fā)“啊”音，暴露咽喉，用壓舌板將舌頭下壓。3.取出一次性無菌拭子，迅速地用力擦拭，咽后壁（懸雍垂后上方）上的分泌物（見圖2）。

4.按照無菌操作規(guī)程在選擇性培養(yǎng)基上進行三區(qū)劃線接種（見圖3），采集好的咽拭子涂在平板第一區(qū)（約1/3平板），再用接種環(huán)劃出第二三區(qū)。接種后的平板應及時保溫轉運到具備培養(yǎng)條件的微生物實驗室，將平板放入35℃-37℃溫箱培養(yǎng)。

5.在無現(xiàn)場接種條件的情況下，可將咽拭子接種至15mL增菌肉湯管中，折斷其手握部分，旋緊瓶蓋。保溫（25℃-35℃）運送至實驗室，用鑷子無菌操作取出咽拭子接種相應的選擇

性培養(yǎng)基一區(qū)，再用接種環(huán)劃出第一、二、三區(qū)，37℃溫箱培養(yǎng)24-48小時，

挑選疑似菌落轉種血平板。

鼻咽拭子標本的采集與處理

1.采樣者以右手執(zhí)拭子，左手按受試者的頭頂部。2.使頂端稍向下彎的拭子從前鼻孔進入，沿下鼻道的底部向后緩緩深入，由于鼻道呈弧形，不可用力過猛，以免發(fā)生外傷出血。3.待拭子頂端到達鼻咽腔后壁時，將拭子稍留片刻（3s），以待反射性咳嗽，然后輕輕旋轉一周，緩緩取出拭子。4.采樣后應立即以三區(qū)劃線法接種于含選擇性添加劑的血瓊脂培養(yǎng)基上，采集好的鼻咽拭子涂第一區(qū)（約1/3平板），再用接種環(huán)劃出第一、二、三區(qū)。如不能立即接種，需放回保存管中，保溫運送至實驗室接種。接種后的拭子如需進行PCR檢測，可將接種后的拭子樣本，在含400μL-600μL，無菌生理鹽水（或pH=7.4的無菌PBS緩沖液）的Eppendorf管中反復捻動洗脫50-80次，在管壁反復用力捻壓拭子，使拭子殘留物充分洗脫至洗脫液中，將洗脫液12,000rpm離心5min，去除上清，沉淀置于-70℃保存，以備后繼提取DNA用于PCR檢測。

咽拭子或鼻咽拭子的處理1.血液標本采集2.血液標本處理-血清或血漿標本的制備

1）血清

全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可用于抗體或核酸檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

2）血漿

可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于1000g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。血液標本的采集與處理“假膜”標本采集疑似咽白喉患者可在咽部呈現(xiàn)較為顯著的“假膜”或稱“偽膜”。采集“假膜”可采用一次性無菌拭子進行刮取，注意操作動作力度適度，過輕不宜刮取，過重容易造成假膜的脫落及脫離部位出血，刮取后的假膜可參照咽拭子后繼操作進行涂片、劃線培養(yǎng)及PCR檢測。痰液標本采集與處理深咳痰液:要求病人深咳后，將咳出的痰液收集于含3ml采樣液的采樣管中?；蚣尤胩狄旱润w積的痰液消化液。痰液消化液儲存液配方見下表。成分質量/體積二硫蘇糖醇0.1g氯化鈉0.78g氯化磷0.02g磷酸氫二鈉0.112g磷酸二氫鉀0.02g水7.5mlPH值7.4±0.2(25C)痰液消化液儲存液配方使用時將儲存液用去離子水稀釋至50ml，與痰液等體積混合使用，或者參照試劑說明進行使用，也可采用痰液等體積的含1g/L蛋白酶K的磷酸鹽緩沖液將痰液化。白喉病原菌檢測流程圖白喉的實驗室檢測技術分離培養(yǎng)——生化鑒定PCR/Real-timePCR毒力實驗血清學檢測白喉桿菌的分離培養(yǎng)鼻咽拭子/咽拭子接種血平板或亞碲酸鉀（選擇性培養(yǎng)基），經37℃12-48h培養(yǎng)后初步鑒定。

在含亞碲酸鉀Hoyle培養(yǎng)基上生長，呈黑色有金屬光澤菌落，菌落直徑0.5mm～1.0mm。在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上可生長。經24h～48h后，形成圓形、突起、白色或灰白色菌落。革蘭染色及鏡下形態(tài)觀察白喉棒狀桿菌為革蘭陽性菌，細長呈棒狀，排列不規(guī)則，常呈人字形、柵欄狀。阿氏(Albert)染色及鏡下形態(tài)觀察涂片經異染顆粒染色液染色后，用顯微鏡觀察，白喉棒狀桿菌菌體呈綠色，異染顆粒呈藍黑色。傳代較多或細菌較老時可能會出現(xiàn)革蘭氏陰性采樣較好的咽拭子或痰標本直接染色，鏡檢可發(fā)現(xiàn)目標菌生化鑒定在尿素卵黃雙糖培養(yǎng)基上，經37℃12h～48h培養(yǎng)后可做初步鑒定。白喉桿菌發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、糊精，均產酸不產氣，不發(fā)酵蔗糖、甘露醇、乳糖、可溶性淀粉。依據形態(tài)、培養(yǎng)、生化特性可將白喉桿菌分為輕、中、重三型。

Real-timePCR檢測

1.DNA提?。ㄔ噭┖?水煮）拭子核酸提取(水煮沸、試劑盒提?。┚浜怂崽崛。兙捎盟蠓蟹ǎ┤怂崽崛。ㄔ噭┖刑崛。┨狄汉怂崽崛。ㄔ噭┖刑崛。?.Real-timePCR檢測（嚴格按照試劑盒說明書進行操作）毒力實驗熒光PCR鑒定Tox毒力基因

（1）不產生毒素

（2）產生毒素，必須同時檢測出ToxA、ToxB基因

Elek平板實驗

Elek平板實驗

將冷卻到50℃左右的Elek培養(yǎng)基注入滅菌平皿中，待瓊脂凝固后，用無菌鑷子取預先制好的白喉抗毒素(每毫升含800~1000U/ml)干燥濾紙條，貼于平板中央表面，置37℃孵箱內約0.5h，烘干表面水分，時間不宜過長，以免影響結果。將試驗菌株劃線接種于平板上成一直線，使其與抗毒素濾紙成直角相交。同時要用已知有毒菌株作陽性對照。于37℃培養(yǎng)，24h、48h、72hq取出觀察結果一次。陽性者于距紙條稍遠處沿接種線開始有絮狀沉淀線出現(xiàn)。如72h仍未出現(xiàn)沉淀線者可作陰性報告。鑒別是否產毒血清學檢測采集病人急性期和恢復期雙份血清進行血清特異性抗體檢測。酶聯(lián)免疫吸附實驗：在利用包被在固相載體上的白喉類毒素捕獲待檢血清中相應抗毒素抗體，形成免疫復合物。除去多余的物質后，加入堿性磷酸酶標記的抗人Ig，使之與上述免疫復合物反應。洗去多余的結合物后，加入酶底物，底物與酶結合物反應，顯色，顏色的深淺與血清中特異性抗體含量呈正比。定量檢測血清或血漿中抗白喉毒素抗體，可用于疫苗接種的監(jiān)控和個體免疫狀態(tài)的確定，防止超免疫狀態(tài)造成的危害。試劑及耗材的儲備1.核酸檢測：白喉棒狀桿菌毒力基因雙重實時熒光定量PCR試劑盒

白喉桿菌（ToxA/ToxB）雙重核酸預分裝試劑盒

細菌DNA提取試劑盒2.生化鑒定試劑：APICor