DB33-T 2492-2022 蝦肝腸胞蟲核酸檢測技術(shù)規(guī)范

ICS

65.020.30CCS

B

4133 DB33/T

2492—2022蝦肝腸胞蟲核酸檢測技術(shù)規(guī)范Technical

acid

of

Enterocytozoonhepatopenaei浙江省市場監(jiān)督管理局 發(fā)

布DB33/T

2492—2022 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T

—《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容可能涉及專利。本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并組織實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：朱凝瑜、鄭曉葉、梁倩蓉、葉鍵、黃家慶、周凡、許婷、丁雪燕、吳洪喜。DB33/T

2492—20221 范圍Enterocytozoon

hepatopenaei，PCR檢測、LAMP結(jié)果判定。物參照執(zhí)行。2 規(guī)范性引用文件標(biāo)準(zhǔn)。SC/T

7103 水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本標(biāo)準(zhǔn)沒有需要界定的術(shù)語和定義。4 縮略語下列縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)Bst

聚合酶：嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶（Bacillus

stearothermophilus

DNA

polymerase）bp：堿基對（base

pair）Ct值：反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（cycle

threshold）DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribo

nucleic

acid）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（

triphosphate）EHP：蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon

heppenatoaei）LAMP：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated

amplification）PCR：聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase

chain

reaction）PEG：聚乙二醇（polyethylene

）SWP：孢子壁蛋白（spore

wall

）SYBR

Green

I

qPCR

Mix：含雙鏈嵌合熒光染色劑的熒光定量預(yù)混液5 試劑和材料除非另有說明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的化學(xué)試劑和蒸餾水或去離子水或相當(dāng)純度的水。DB33/T

2492—20225.1 無水乙醇。5.2 95

%乙醇：95

無水乙醇，加水定容至

mL。5.3 70

%乙醇：70

無水乙醇，加水定容至

mL。5.40.45

μm

硝酸纖維素膜。5.5 3%牛肉膏洗脫液：30.0g

至

1mL

，室溫保存。5.6 16

%PEG8000：160.0

gPEG8000、17.5

gNaCl

加水溶解，定容至

1

15min，室溫保存。5.7 磷酸氫二鈉(Na2HPO4）（

mol/L）：71.6

gNa2HPO4·12H2O

加水溶解，調(diào)節(jié)

至

，定容至

1000

mL，高壓滅菌

15

min，室溫保存。5.8 抽提緩沖液：1mL1mol/L

Tris·HCl

(pH8.0)、20mol/L

EDTA

(pH8.0)、2mL1

胰

酶、5

mL10

%SDS

加水溶解，定容至

mL，室溫貯存。5.9 蛋白酶

K（20

mg/mL）：

℃保存。5.10 This

平衡酚（飽和酚）、10

mol/L

乙酸銨、酚/三氯甲烷/異戊醇（）、三氯甲烷/醇（24:15.11 TE

緩沖液：10mol/L

·

(pH8.0)、2mL0.5

mol/L

EDTA（pH8.0

1mL，高壓滅菌后

4

℃保存。5.12Taq

5

μL-20

℃保存，避免反復(fù)凍融。5.13 10×

緩沖液：隨

Taq

聚合酶提供，-20

℃保存。5.14氯化鎂（MgCl2）溶液（

mmol/L）：-20

℃保存。5.15 dNTP

dCTP、dGTP、dATP、dTTP

各

mmol/L

的混合物，

℃保存。5.16 套式

引物：兩對引物（F514

和

R514、F147

和

R147）序列及其在靶基因中的位置見附錄

A中的

，-20

℃保存。5.17 1×

電泳緩沖液：242

gTris、100

mL0.5

mol/LEDTA

、57.1

mL

冰乙酸，加水定容至

1000

mL，室溫保存，使用時稀釋

50

倍。5.18 瓊脂糖：電泳級。5.19 樣品緩沖液：40

g

蔗糖加水溶解，定容至

1

mL，加入

0.25

g

溴酚藍(lán)溶解后，4

℃保存。5.20 電泳核酸染料：溴化乙錠或

4S

Green

5.21 DNA

，

℃保存。5.22 SYBR

Green

I

qPCR

Mix。5.23熒光定量

F118

和

R118

A

中的

A.2，-20

℃保存。25.24 10×thermolPol

200mmol/L

Tris·HCl(pH8.0)、mmol/L

NH4）SO42100

mmol/L

氯化鉀（KCl20

硫酸鎂（MgSO4）、1

%

Triton

X-100。5.25 甜菜堿，5

mol/L。5.26 MgSO4，150

mmol/L。5.27 Bst

DNA

聚合酶，8

U/μL。5.28 LAMP

引物：三對引物（

和

B3、FIP

和

、FLP

和

BLP）序列及其在靶基因中的位置見附錄

A中的

，-20

℃保存。5.29 陽性對照：已知受

感染的對蝦樣品提取的

DNA，-20

℃保存。5.30 陰性對照：已知未受

EHP

感染的對蝦樣品提取的

，-20

℃保存。5.31 空白對照：無菌雙蒸水。DB33/T

2492—20226 儀器和設(shè)備6.1

PCR

擴(kuò)增儀。6.2

熒光定量

6.3

恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增檢測儀。6.4

電泳儀：輸出直流電壓

0

V～600

V。6.5

水平電泳槽：50

mL～500

，帶有凝膠船及樣孔梳。6.6

微量移液器及適配吸頭，建議使用帶濾芯的吸頭。6.7

凝膠成像儀。6.8

水浴鍋或金屬浴。6.9

普通冰箱：具冷藏箱，并帶-18

℃以下冷凍箱體。6.10

離心機(jī)：轉(zhuǎn)速可達(dá)

000

r/min

以上。6.11

超聲波破碎儀：20

±2

kHz。6.12

0.2

mL

PCR

1.5

mL、

mL、5.0

mL

離心管：經(jīng)高壓滅菌，一次性使用。6.13

無菌研磨棒：適用于

1.5

離心管，經(jīng)高壓滅菌，一次性使用。6.14

分析天平：最小分度值為

1

mg。6.15

真空抽濾泵。7樣品采集和處理7.1 樣品的采集7.1.1 生物樣品7.1.1.1 樣品采集的要求和數(shù)量按

SC/T

7103

的規(guī)定。7.1.1.2 對蝦受精卵、幼體、仔蝦及體長3cm以下稚蝦取完整個體；幼蝦至成蝦取肝胰腺、腸道；鹵蟲、豐年蟲等餌料生物樣品取完整個體，冷藏運(yùn)輸進(jìn)行核酸抽提。或置于滅菌采樣容器內(nèi)，加入待檢樣三倍體積的

%乙醇沒過待檢樣，-20

℃保存。7.1.2 水樣用無菌容器采集500

mL，冷藏運(yùn)輸進(jìn)行核酸抽提。或-20

℃保存待檢。7.2 樣品處理7.2.1 通用要求樣品處理過程中應(yīng)避免交叉污染。7.2.2 生物樣將采集樣品用研磨棒研磨均勻，取10

mg～

組織勻漿液，

置于滅菌

mL的離心管中，用于核酸提取。7.2.3 水樣7.2.3.1 取

100

mL

水樣經(jīng)

0.45

μm

硝酸纖維素膜抽濾后，取出硝酸纖維素膜并剪碎，放入裝有

mL的

3

%牛肉膏洗脫液及鋯珠的

2

離心管中，震蕩

min～30

，或用超聲破碎儀破碎

min。DB33/T

2492—20227.2.3.2 取出上清轉(zhuǎn)移至無菌的

5

離心管中。加入等體積的

16

%

PEG8

溶液，震蕩充分混勻，調(diào)節(jié)

至

7.0，4

3

h

或過夜。7.2.3.3 4

℃下

12

r/min

離心

5

min，棄上清。加入

Na2

4

μL，震蕩至重懸沉淀。7.2.3.4 4

℃下

12

r/min

離心

5

min，取上清用于核酸抽提。8 核酸抽提8.1經(jīng)

7.2

處理樣品，按以下方法進(jìn)行核酸抽提。8.2 加入抽提緩沖液

450

μL、蛋白酶

K3

μL，混勻，56

℃孵育

3

h。8.3 冷卻至室溫，加入等體積平衡酚，顛倒混合

min，于

000r/min

3，取上層水相至新1.5

mL

離心管中。8.4加入等體積酚/三氯甲烷/異戊醇（），顛倒混合

min

10

1

min，取上層水相至新

離心管中。8.5 加溶液等體積三氯甲烷/異戊醇(24:1)，顛倒混合

min

10

000

r/min

1

，取上層水相至新

1.5

mL

離心管中。8.6 加入乙酸銨

100μL

℃放置

2h。10r/min

離心

10

，棄上清。8.7 用

70%乙醇洗滌沉淀

2

10r/min

離心

5min8.8 加入滅菌雙蒸水

50μL～μL

DNA。若

DNA

樣品需保存，宜用

TE

緩沖液

50μL～100μL

并保存于

8.9 也可采用同等效果商業(yè)化

DNA

提取試劑盒抽提

DNA。9 PCR

檢測方法9.1通用要求樣品的PCR擴(kuò)增應(yīng)在反應(yīng)區(qū)獨(dú)立完成，避免造成區(qū)域間污染。實(shí)驗(yàn)室分區(qū)要求按附錄B執(zhí)行。9.2 套式

9.2.1第一輪

PCR

反應(yīng)9.2.1.1 PCR

反應(yīng)體系：在

mL

管中加入

10×

2.5μL，MgCl2

1.5μL，dNTP

μL，引物

F514

和

R514

各

1

μL，Taq

酶

μL，檢測樣品

DNA

1

μL，最后加滅菌雙蒸水至

μL

體積（或者按商品化預(yù)混液說明書配制反應(yīng)體系）。同時設(shè)陽性對照、陰性對照及空白對照。短暫離心后將

PCR管置于

PCR

儀中。9.2.1.2 PCR

反應(yīng)條件：95

℃

5；95

℃

30s，

℃

30s，68

℃

45s，

次循環(huán)；68

℃

5min；4

℃保溫。9.2.2 第二輪

PCR

反應(yīng)9.2.2.1 PCR反應(yīng)體系為：在mLPCR管中加入10×PCR2.5μL，MgCl2

μL，dNTP

μL，引物

F147

和

R147

各

1

μL，Taq

酶

μL，第一輪反應(yīng)產(chǎn)物

1μL，最后加滅菌雙蒸水至

25

μL

按商品化預(yù)混液說明書配制反應(yīng)體系）。短暫離心后將

PCR

儀中。9.2.2.2 PCR

反應(yīng)條件為：95

℃

5；95

℃

30s，64

℃

30s，68

℃

s，20

次循環(huán)；68

℃

5；4

℃保溫。DB33/T

2492—20229.2.3 瓊脂糖凝膠電泳用1×電泳緩沖液配制%1μg/mL加樣孔朝負(fù)極，加入1×電泳緩沖液至沒過膠面1

mm～2

mm。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6

μL和樣品緩沖液2

μL混DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對照。5V/cm30min1/2～2/3處時停止電泳，凝膠成像儀觀察并判斷結(jié)果。若條帶未區(qū)分開，可適當(dāng)增加電泳時間。9.2.4 結(jié)果判定9.2.4.1 陽性對照第一輪

PCR

在

bp

處有條帶，或/和第二輪

PCR

在

處有條帶，陰性對照和空白對照沒有相應(yīng)條帶，實(shí)驗(yàn)有效。9.2.4.2 待測樣品第一輪

PCR

在

bp

處有條帶，或/和第二輪

PCR

在

處有條帶的，判定為陽性。9.2.4.3 待測樣品第一輪

在

514bp

在147處無條帶的，可判定為樣品陰性。9.2.4.4 結(jié)果判定可疑時，應(yīng)用其他檢測方法進(jìn)行確認(rèn)。9.3熒光定量

9.3.1 反應(yīng)體系在熒光PCR管中加入2×

Green

I

qPCR

Mix

10

μL，引物F118和R118各0.8

μL，檢測樣品DNA

1μLμL陰性對照及空白對照。短暫離心后將PCR管置于熒光定量儀中。9.3.2 反應(yīng)條件95

℃

30

s；95

℃

5

s，

℃

30

s，個循環(huán)。9.3.3 結(jié)果判定9.3.3.1 陽性對照

30且有明顯

S

型擴(kuò)增曲線，同時陰性對照和空白對照

30

且無明顯

S型擴(kuò)增曲線，判斷結(jié)果有效。9.3.3.2 待測樣品

30

且有明顯

S

型擴(kuò)增曲線，結(jié)果為陽性。9.3.3.3 待測樣品

35

或無明顯

S

型擴(kuò)增曲線，結(jié)果為陰性。9.3.3.4 待測樣品

值

30＜Ct≤

時，樣品為疑似陽性，應(yīng)用其他檢測方法確認(rèn)。9.4 LAMP

法9.4.1 反應(yīng)體系在熒光PCR管中加入×緩沖液

μL、外側(cè)引物F3和B3各0.5

μL，內(nèi)測引物和各1μL和各μL，dNTP4μL4μL，MgSO4

1μL，Bst

DNA聚合酶

1μL，2μL，最后加滅菌雙蒸水至25

μL體積（或者按商品化預(yù)混液說明書配制反應(yīng)體系）。同時設(shè)陽性對照、陰性對照及空白對照。短暫離心后將PCR管置于恒溫?zé)晒釶CR儀中或熒光定量儀中選擇SYBR通道。9.4.2 反應(yīng)條件63

℃擴(kuò)增

min。9.4.3 結(jié)果判定DB33/T

2492—20229.4.3.1

陽性對照反應(yīng)產(chǎn)生典型

S

型擴(kuò)增曲線且陰性對照和空白對照反應(yīng)產(chǎn)生非

S

型擴(kuò)增曲線時，結(jié)果有效。9.4.3.2

待測樣品反應(yīng)產(chǎn)生典型

S

型擴(kuò)增曲線，結(jié)果為陽性。9.4.3.3

待測樣品反應(yīng)產(chǎn)生類似平直的非

S

型擴(kuò)增曲線，則結(jié)果為陰性。9.4.3.4

結(jié)果判定可疑時，應(yīng)用其他檢測方法進(jìn)行確認(rèn)。10 綜合判定10.1 套式

結(jié)果陽性、或熒光定量

PCR

結(jié)果陽性、或

LAMP

結(jié)果陽性，符合其中一項(xiàng)則判定為樣品EHP

核酸陽性。10.2 當(dāng)套式

PCR

、LAMP

認(rèn)。’）F514TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTT10

514

R514CACGATGTGTCTTTGCAATTTTC10

F14710

147

R147GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA10

DB33/T

2492—2022AA附

錄 A（資料性）EHP

檢測方法引物序列及其在靶基因中的位置A.1 EHPPCR引物序列及其在靶基因中的位置A.1.1 套式引物序列套式A.1。表A.1 EHP

引物序列A.1.2 套式引物在靶基因中的位置套式引物在靶基因中的位置見圖。圖A.1 EHP

引物在靶基因中的位置A.2 EHP熒光定量PCR引物序列及其在靶基因中的位置A.2.1 熒光定量引物序列熒光定量引物序列及濃度見表A.2?！〧3TAGAAGATGCAAAGAGATATGTTGA10

B310

FIPTTACTTAAACCCTTAACAACACTCTAAGTTACCAGAAGGTTATGAAGAA40

BIPTTGGCGGCACAATTCTCAATGTCTGTGTAAATATCGTCTCTTT40

FLPAACATTTAGTTCGTCACGCATTT40

BLPTTCAAACACTGTAAACCTTAAAGCA40

’