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文檔簡介
ICS
65.020.30CCS
B
4133 DB33/T
2492—2022蝦肝腸胞蟲核酸檢測技術(shù)規(guī)范Technical
acid
of
Enterocytozoonhepatopenaei浙江省市場監(jiān)督管理局 發(fā)
布DB33/T
2492—2022 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T
—《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容可能涉及專利。本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并組織實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:朱凝瑜、鄭曉葉、梁倩蓉、葉鍵、黃家慶、周凡、許婷、丁雪燕、吳洪喜。DB33/T
2492—20221 范圍Enterocytozoon
hepatopenaei,PCR檢測、LAMP結(jié)果判定。物參照執(zhí)行。2 規(guī)范性引用文件標(biāo)準(zhǔn)。SC/T
7103 水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本標(biāo)準(zhǔn)沒有需要界定的術(shù)語和定義。4 縮略語下列縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)Bst
聚合酶:嗜熱脂肪芽孢桿菌DNA聚合酶(Bacillus
stearothermophilus
DNA
polymerase)bp:堿基對(base
pair)Ct值:反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(cycle
threshold)DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribo
nucleic
acid)dNTP:脫氧核糖核苷三磷酸(
triphosphate)EHP:蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon
heppenatoaei)LAMP:環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated
amplification)PCR:聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase
chain
reaction)PEG:聚乙二醇(polyethylene
)SWP:孢子壁蛋白(spore
wall
)SYBR
Green
I
qPCR
Mix:含雙鏈嵌合熒光染色劑的熒光定量預(yù)混液5 試劑和材料除非另有說明,在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的化學(xué)試劑和蒸餾水或去離子水或相當(dāng)純度的水。DB33/T
2492—20225.1 無水乙醇。5.2 95
%乙醇:95
無水乙醇,加水定容至
mL。5.3 70
%乙醇:70
無水乙醇,加水定容至
mL。5.40.45
μm
硝酸纖維素膜。5.5 3%牛肉膏洗脫液:30.0g
至
1mL
,室溫保存。5.6 16
%PEG8000:160.0
gPEG8000、17.5
gNaCl
加水溶解,定容至
1
15min,室溫保存。5.7 磷酸氫二鈉(Na2HPO4)(
mol/L):71.6
gNa2HPO4·12H2O
加水溶解,調(diào)節(jié)
至
,定容至
1000
mL,高壓滅菌
15
min,室溫保存。5.8 抽提緩沖液:1mL1mol/L
Tris·HCl
(pH8.0)、20mol/L
EDTA
(pH8.0)、2mL1
胰
酶、5
mL10
%SDS
加水溶解,定容至
mL,室溫貯存。5.9 蛋白酶
K(20
mg/mL):
℃保存。5.10 This
平衡酚(飽和酚)、10
mol/L
乙酸銨、酚/三氯甲烷/異戊醇()、三氯甲烷/醇(24:15.11 TE
緩沖液:10mol/L
·
(pH8.0)、2mL0.5
mol/L
EDTA(pH8.0
1mL,高壓滅菌后
4
℃保存。5.12Taq
5
μL-20
℃保存,避免反復(fù)凍融。5.13 10×
緩沖液:隨
Taq
聚合酶提供,-20
℃保存。5.14氯化鎂(MgCl2)溶液(
mmol/L):-20
℃保存。5.15 dNTP
dCTP、dGTP、dATP、dTTP
各
mmol/L
的混合物,
℃保存。5.16 套式
引物:兩對引物(F514
和
R514、F147
和
R147)序列及其在靶基因中的位置見附錄
A中的
,-20
℃保存。5.17 1×
電泳緩沖液:242
gTris、100
mL0.5
mol/LEDTA
、57.1
mL
冰乙酸,加水定容至
1000
mL,室溫保存,使用時稀釋
50
倍。5.18 瓊脂糖:電泳級。5.19 樣品緩沖液:40
g
蔗糖加水溶解,定容至
1
mL,加入
0.25
g
溴酚藍(lán)溶解后,4
℃保存。5.20 電泳核酸染料:溴化乙錠或
4S
Green
5.21 DNA
,
℃保存。5.22 SYBR
Green
I
qPCR
Mix。5.23熒光定量
F118
和
R118
A
中的
A.2,-20
℃保存。25.24 10×thermolPol
200mmol/L
Tris·HCl(pH8.0)、mmol/L
NH4)SO42100
mmol/L
氯化鉀(KCl20
硫酸鎂(MgSO4)、1
%
Triton
X-100。5.25 甜菜堿,5
mol/L。5.26 MgSO4,150
mmol/L。5.27 Bst
DNA
聚合酶,8
U/μL。5.28 LAMP
引物:三對引物(
和
B3、FIP
和
、FLP
和
BLP)序列及其在靶基因中的位置見附錄
A中的
,-20
℃保存。5.29 陽性對照:已知受
感染的對蝦樣品提取的
DNA,-20
℃保存。5.30 陰性對照:已知未受
EHP
感染的對蝦樣品提取的
,-20
℃保存。5.31 空白對照:無菌雙蒸水。DB33/T
2492—20226 儀器和設(shè)備6.1
PCR
擴(kuò)增儀。6.2
熒光定量
6.3
恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增檢測儀。6.4
電泳儀:輸出直流電壓
0
V~600
V。6.5
水平電泳槽:50
mL~500
,帶有凝膠船及樣孔梳。6.6
微量移液器及適配吸頭,建議使用帶濾芯的吸頭。6.7
凝膠成像儀。6.8
水浴鍋或金屬浴。6.9
普通冰箱:具冷藏箱,并帶-18
℃以下冷凍箱體。6.10
離心機(jī):轉(zhuǎn)速可達(dá)
000
r/min
以上。6.11
超聲波破碎儀:20
±2
kHz。6.12
0.2
mL
PCR
1.5
mL、
mL、5.0
mL
離心管:經(jīng)高壓滅菌,一次性使用。6.13
無菌研磨棒:適用于
1.5
離心管,經(jīng)高壓滅菌,一次性使用。6.14
分析天平:最小分度值為
1
mg。6.15
真空抽濾泵。7樣品采集和處理7.1 樣品的采集7.1.1 生物樣品7.1.1.1 樣品采集的要求和數(shù)量按
SC/T
7103
的規(guī)定。7.1.1.2 對蝦受精卵、幼體、仔蝦及體長3cm以下稚蝦取完整個體;幼蝦至成蝦取肝胰腺、腸道;鹵蟲、豐年蟲等餌料生物樣品取完整個體,冷藏運(yùn)輸進(jìn)行核酸抽提。或置于滅菌采樣容器內(nèi),加入待檢樣三倍體積的
%乙醇沒過待檢樣,-20
℃保存。7.1.2 水樣用無菌容器采集500
mL,冷藏運(yùn)輸進(jìn)行核酸抽提。或-20
℃保存待檢。7.2 樣品處理7.2.1 通用要求樣品處理過程中應(yīng)避免交叉污染。7.2.2 生物樣將采集樣品用研磨棒研磨均勻,取10
mg~
組織勻漿液,
置于滅菌
mL的離心管中,用于核酸提取。7.2.3 水樣7.2.3.1 取
100
mL
水樣經(jīng)
0.45
μm
硝酸纖維素膜抽濾后,取出硝酸纖維素膜并剪碎,放入裝有
mL的
3
%牛肉膏洗脫液及鋯珠的
2
離心管中,震蕩
min~30
,或用超聲破碎儀破碎
min。DB33/T
2492—20227.2.3.2 取出上清轉(zhuǎn)移至無菌的
5
離心管中。加入等體積的
16
%
PEG8
溶液,震蕩充分混勻,調(diào)節(jié)
至
7.0,4
3
h
或過夜。7.2.3.3 4
℃下
12
r/min
離心
5
min,棄上清。加入
Na2
4
μL,震蕩至重懸沉淀。7.2.3.4 4
℃下
12
r/min
離心
5
min,取上清用于核酸抽提。8 核酸抽提8.1經(jīng)
7.2
處理樣品,按以下方法進(jìn)行核酸抽提。8.2 加入抽提緩沖液
450
μL、蛋白酶
K3
μL,混勻,56
℃孵育
3
h。8.3 冷卻至室溫,加入等體積平衡酚,顛倒混合
min,于
000r/min
3,取上層水相至新1.5
mL
離心管中。8.4加入等體積酚/三氯甲烷/異戊醇(),顛倒混合
min
10
1
min,取上層水相至新
離心管中。8.5 加溶液等體積三氯甲烷/異戊醇(24:1),顛倒混合
min
10
000
r/min
1
,取上層水相至新
1.5
mL
離心管中。8.6 加入乙酸銨
100μL
℃放置
2h。10r/min
離心
10
,棄上清。8.7 用
70%乙醇洗滌沉淀
2
10r/min
離心
5min8.8 加入滅菌雙蒸水
50μL~μL
DNA。若
DNA
樣品需保存,宜用
TE
緩沖液
50μL~100μL
并保存于
8.9 也可采用同等效果商業(yè)化
DNA
提取試劑盒抽提
DNA。9 PCR
檢測方法9.1通用要求樣品的PCR擴(kuò)增應(yīng)在反應(yīng)區(qū)獨(dú)立完成,避免造成區(qū)域間污染。實(shí)驗(yàn)室分區(qū)要求按附錄B執(zhí)行。9.2 套式
9.2.1第一輪
PCR
反應(yīng)9.2.1.1 PCR
反應(yīng)體系:在
mL
管中加入
10×
2.5μL,MgCl2
1.5μL,dNTP
μL,引物
F514
和
R514
各
1
μL,Taq
酶
μL,檢測樣品
DNA
1
μL,最后加滅菌雙蒸水至
μL
體積(或者按商品化預(yù)混液說明書配制反應(yīng)體系)。同時設(shè)陽性對照、陰性對照及空白對照。短暫離心后將
PCR管置于
PCR
儀中。9.2.1.2 PCR
反應(yīng)條件:95
℃
5;95
℃
30s,
℃
30s,68
℃
45s,
次循環(huán);68
℃
5min;4
℃保溫。9.2.2 第二輪
PCR
反應(yīng)9.2.2.1 PCR反應(yīng)體系為:在mLPCR管中加入10×PCR2.5μL,MgCl2
μL,dNTP
μL,引物
F147
和
R147
各
1
μL,Taq
酶
μL,第一輪反應(yīng)產(chǎn)物
1μL,最后加滅菌雙蒸水至
25
μL
按商品化預(yù)混液說明書配制反應(yīng)體系)。短暫離心后將
PCR
儀中。9.2.2.2 PCR
反應(yīng)條件為:95
℃
5;95
℃
30s,64
℃
30s,68
℃
s,20
次循環(huán);68
℃
5;4
℃保溫。DB33/T
2492—20229.2.3 瓊脂糖凝膠電泳用1×電泳緩沖液配制%1μg/mL加樣孔朝負(fù)極,加入1×電泳緩沖液至沒過膠面1
mm~2
mm。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6
μL和樣品緩沖液2
μL混DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對照。5V/cm30min1/2~2/3處時停止電泳,凝膠成像儀觀察并判斷結(jié)果。若條帶未區(qū)分開,可適當(dāng)增加電泳時間。9.2.4 結(jié)果判定9.2.4.1 陽性對照第一輪
PCR
在
bp
處有條帶,或/和第二輪
PCR
在
處有條帶,陰性對照和空白對照沒有相應(yīng)條帶,實(shí)驗(yàn)有效。9.2.4.2 待測樣品第一輪
PCR
在
bp
處有條帶,或/和第二輪
PCR
在
處有條帶的,判定為陽性。9.2.4.3 待測樣品第一輪
在
514bp
在147處無條帶的,可判定為樣品陰性。9.2.4.4 結(jié)果判定可疑時,應(yīng)用其他檢測方法進(jìn)行確認(rèn)。9.3熒光定量
9.3.1 反應(yīng)體系在熒光PCR管中加入2×
Green
I
qPCR
Mix
10
μL,引物F118和R118各0.8
μL,檢測樣品DNA
1μLμL陰性對照及空白對照。短暫離心后將PCR管置于熒光定量儀中。9.3.2 反應(yīng)條件95
℃
30
s;95
℃
5
s,
℃
30
s,個循環(huán)。9.3.3 結(jié)果判定9.3.3.1 陽性對照
30且有明顯
S
型擴(kuò)增曲線,同時陰性對照和空白對照
30
且無明顯
S型擴(kuò)增曲線,判斷結(jié)果有效。9.3.3.2 待測樣品
30
且有明顯
S
型擴(kuò)增曲線,結(jié)果為陽性。9.3.3.3 待測樣品
35
或無明顯
S
型擴(kuò)增曲線,結(jié)果為陰性。9.3.3.4 待測樣品
值
30<Ct≤
時,樣品為疑似陽性,應(yīng)用其他檢測方法確認(rèn)。9.4 LAMP
法9.4.1 反應(yīng)體系在熒光PCR管中加入×緩沖液
μL、外側(cè)引物F3和B3各0.5
μL,內(nèi)測引物和各1μL和各μL,dNTP4μL4μL,MgSO4
1μL,Bst
DNA聚合酶
1μL,2μL,最后加滅菌雙蒸水至25
μL體積(或者按商品化預(yù)混液說明書配制反應(yīng)體系)。同時設(shè)陽性對照、陰性對照及空白對照。短暫離心后將PCR管置于恒溫?zé)晒釶CR儀中或熒光定量儀中選擇SYBR通道。9.4.2 反應(yīng)條件63
℃擴(kuò)增
min。9.4.3 結(jié)果判定DB33/T
2492—20229.4.3.1
陽性對照反應(yīng)產(chǎn)生典型
S
型擴(kuò)增曲線且陰性對照和空白對照反應(yīng)產(chǎn)生非
S
型擴(kuò)增曲線時,結(jié)果有效。9.4.3.2
待測樣品反應(yīng)產(chǎn)生典型
S
型擴(kuò)增曲線,結(jié)果為陽性。9.4.3.3
待測樣品反應(yīng)產(chǎn)生類似平直的非
S
型擴(kuò)增曲線,則結(jié)果為陰性。9.4.3.4
結(jié)果判定可疑時,應(yīng)用其他檢測方法進(jìn)行確認(rèn)。10 綜合判定10.1 套式
結(jié)果陽性、或熒光定量
PCR
結(jié)果陽性、或
LAMP
結(jié)果陽性,符合其中一項(xiàng)則判定為樣品EHP
核酸陽性。10.2 當(dāng)套式
PCR
、LAMP
認(rèn)。’)F514TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTT10
514
R514CACGATGTGTCTTTGCAATTTTC10
F14710
147
R147GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA10
DB33/T
2492—2022AA附
錄 A(資料性)EHP
檢測方法引物序列及其在靶基因中的位置A.1 EHPPCR引物序列及其在靶基因中的位置A.1.1 套式引物序列套式A.1。表A.1 EHP
引物序列A.1.2 套式引物在靶基因中的位置套式引物在靶基因中的位置見圖。圖A.1 EHP
引物在靶基因中的位置A.2 EHP熒光定量PCR引物序列及其在靶基因中的位置A.2.1 熒光定量引物序列熒光定量引物序列及濃度見表A.2?!〧3TAGAAGATGCAAAGAGATATGTTGA10
B310
FIPTTACTTAAACCCTTAACAACACTCTAAGTTACCAGAAGGTTATGAAGAA40
BIPTTGGCGGCACAATTCTCAATGTCTGTGTAAATATCGTCTCTTT40
FLPAACATTTAGTTCGTCACGCATTT40
BLPTTCAAACACTGTAAACCTTAAAGCA40
’
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