禽病病原之實(shí)驗(yàn)室檢測方法0425課件

禽病病原之實(shí)驗(yàn)室檢測方法沈元診斷研究效勞中心客戶疾病診斷研究服務(wù)中心養(yǎng)殖場生產(chǎn)管理服務(wù)中心產(chǎn)品技術(shù)服務(wù)中心信息咨詢服務(wù)中心

診斷/監(jiān)測聚焦三大核心功能研究服務(wù)疾病診斷研究中心5個(gè)業(yè)務(wù)室1個(gè)綜合管理室禽病毒檢測室：豬病毒檢測室：血清學(xué)檢測室：細(xì)菌學(xué)檢測室：診斷試劑開發(fā)室：樣品接收與登記檢測任務(wù)下達(dá)檢測報(bào)告的復(fù)核與遞送客戶溝通與結(jié)果分析菌毒種歸檔與保藏實(shí)驗(yàn)室和物料平衡管理動(dòng)物疾病診斷研究效勞中心疾病診斷研究中心四大特點(diǎn)專業(yè)：人員、場所、試劑全面：禽16項(xiàng)；豬13項(xiàng)，細(xì)菌12項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)：有標(biāo)準(zhǔn)可依研究：集團(tuán)化客戶的專題合作研究先進(jìn)的儀器設(shè)備先進(jìn)的儀器設(shè)備先進(jìn)的儀器設(shè)備先進(jìn)的儀器設(shè)備先進(jìn)的儀器設(shè)備先進(jìn)的儀器設(shè)備先進(jìn)的設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)的操作程序定點(diǎn)定人定性定量定期養(yǎng)殖場定性檢測抓住源頭合理定點(diǎn)系統(tǒng)監(jiān)測專人效勞專家咨詢固定數(shù)量全面監(jiān)測固定周期持續(xù)監(jiān)測五定監(jiān)測機(jī)制血清學(xué)生化組織病理切片藥理學(xué)快速診斷基因分析區(qū)分野毒與疫苗毒病源分離與鑒定耐藥性分析抗原性分析環(huán)境監(jiān)測環(huán)境監(jiān)測毒物分析病原鑒定病理變化確診疾病制定方案監(jiān)測免疫效果野毒感染狀況篩選優(yōu)質(zhì)藥物分子微生物學(xué)微生物學(xué)診斷研究VIIVIVIVIIIIII實(shí)驗(yàn)室診斷：確診疾病，制定防控方案流行病學(xué)調(diào)查：掌握不同地區(qū)、不同季節(jié)疾病流行動(dòng)態(tài)，事先預(yù)防病源基因進(jìn)化分析研究：掌握病源分子生物學(xué)變化情況，篩選疫苗毒株細(xì)菌的耐藥性分析：篩選特效藥物，優(yōu)化用藥方案環(huán)境監(jiān)控：改善飼養(yǎng)環(huán)境、評價(jià)生物平安體系血清監(jiān)測：評價(jià)免疫狀態(tài)、評價(jià)疫苗效果、確定免疫程序、診斷、控制凈化病源研究：研究病源抗原性變化，制備“適應(yīng)性〞疫苗七項(xiàng)效勞內(nèi)容NO.1病原檢測意義NO.2病原采集與檢測流程N(yùn)O.3PCR快速檢測法NO.4病毒分離法4月9日晚間消息，國內(nèi)民營預(yù)防醫(yī)療效勞提供機(jī)構(gòu)愛康國賓正式在納斯達(dá)克掛牌上市。成為國內(nèi)首家健康體檢赴美IPO上市企業(yè)。健康養(yǎng)殖的現(xiàn)狀食品平安；養(yǎng)殖及生物平安；疫病的多樣化、復(fù)雜化、混合感染等；藥物的嚴(yán)格合理使用及殘留；規(guī)模放大的瓶頸；病原的多方面威脅病毒擴(kuò)散：禽流感、新城疫己進(jìn)入全球生態(tài)系統(tǒng)，由于防控措施中的某些漏洞，致使病原更廣泛的擴(kuò)散。免疫抑制：傳染性囊病、馬立克氏病、雞傳染性貧血、J亞型淋巴白血病、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥、呼腸孤病毒病等的發(fā)生，造成免疫抑制，降低雞體免疫力，更易被細(xì)菌、支原體感染。種代凈化：種禽企業(yè)對經(jīng)胚傳播疾病凈化措施重視不夠。必須強(qiáng)化對種雞的沙門菌、支原體、禽白血病、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒、呼腸孤病毒的凈化工作，以保證養(yǎng)禽業(yè)的健康開展。禽病病原檢測內(nèi)容確定禽病病原，對雞群疫病防控做到有的放矢；監(jiān)測隱性感染，了解雞群健康狀況；總結(jié)疫病流行，為免疫毒株選擇提供參考數(shù)據(jù)；進(jìn)行疫病凈化，為實(shí)現(xiàn)種禽健康養(yǎng)殖提供可行性方法別離流行毒株，為制備自制抗原和自家疫苗提供種毒材料基因測序比對，建立養(yǎng)殖集團(tuán)病毒基因數(shù)據(jù)庫病原檢測流程檢測樣品的接收和初步分析雞胚法分離病毒

RT-PCR鑒定HA確定血凝性；HI確定ND、AI初步確定病原出具PCR檢測報(bào)告確定病原種類出具完整檢測報(bào)告組織尿囊液進(jìn)一步的測序工作樣品的采集與運(yùn)輸正確采樣的重要性以IBV為例IB根據(jù)臨床上病變類型主要分為：呼吸道型、腎型。目前流行發(fā)病以腎型發(fā)生最為普遍。呼吸道出現(xiàn)呼吸困難，有啰音或喘鳴音，雛雞感染可引起死亡。青年雞和產(chǎn)蛋雞感染后可引起產(chǎn)蛋雞停產(chǎn)或產(chǎn)蛋下降，產(chǎn)軟殼蛋、沙殼蛋或畸形蛋，蛋清稀薄如水。病雞排白色稀糞，脫水，腎臟腫大，花斑腎，死亡率高。符合上述臨床病癥之一者可以疑心感染雞傳染性支氣管炎病毒，確診需經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。1.臨床診斷采樣工具2.無菌、平安采樣IBV病料采集急性呼吸道型的病雞，應(yīng)采取氣管滲出物；對于剛撲殺的病雞那么采取支氣管和肺組織。腎型和產(chǎn)蛋下降的病雞，應(yīng)采取病雞的腎臟和輸卵管。也可從大腸，尤其是盲腸扁桃體或糞便別離病毒，但從消化道別離到的病毒未必與現(xiàn)流行株或發(fā)生的病毒有直接關(guān)系。3.適時(shí)采樣4.合理、典型采樣IBV病料采集樣品量：要足量，且有備份量

—血清：至少0.5ml

—組織：2-3g

—棉拭子：旋轉(zhuǎn)2-3次，且停留3-5s5.適量采樣咽喉、腭裂、泄殖腔棉拭子采集方法如下：取咽喉拭子時(shí)將拭子深入喉頭口及上顎裂來回刮3～5次取咽喉分泌液；取泄殖腔拭子時(shí)將拭子深入泄殖腔并沾取少量糞便。將棉拭子浸入分裝有生理鹽水的離心管，折斷超出局部，蓋緊，并送實(shí)驗(yàn)室檢測。組織樣品的保存采集樣品用封口袋包裝，做好標(biāo)記〔編號、棟舍、場名〕，防止產(chǎn)生對檢測的信息干擾。病毒檢驗(yàn)樣品，假設(shè)24小時(shí)內(nèi)要送到實(shí)驗(yàn)室，可冰袋冷藏處理。假設(shè)超過24小時(shí)的應(yīng)凍結(jié)處理。夏天不建議送檢全雞檢測。最終原那么就是選擇較厚的泡沫盒，同時(shí)多放冰塊。病料的包裝病料檢測前處理將病料放在含有10000IU/mL青霉素和10mg/mL鏈霉素的pH值為7.4的PBS內(nèi)，置于冰盒內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室。將病料磨碎，加含抗菌素的PBS制成1:5體積比組織懸液，反復(fù)凍融，以3000g離心20分鐘，取上清液，參加濃度為1000IU/mL的青霉素和終濃度為1mg/mL的鏈霉素，37℃作用1小時(shí)后用于PCR檢測或雞胚接種疾病名稱病料采集部位雞新城疫（ND）腦組織、氣管、肺臟、咽喉拭子禽流感（AI）氣管、肺臟、輸卵管、咽喉、泄殖腔拭子雞傳染性支氣管炎（IB）氣管、肺臟、腎臟、咽喉拭子雞傳染性喉氣管炎（AILT）氣管滲出物、氣管、肺禽滑液囊支原體（MS）血液、關(guān)節(jié)禽敗血支原體（MG）血液、氣管、肺產(chǎn)蛋下降綜合征（EDS）輸卵管、畸形蛋、變形卵泡包涵體肝炎（IBH）肝臟、腎臟疾病名稱病料采集部位雞馬立克?。∕D）腫瘤組織、毛囊、全血禽白血病（ALV）種蛋、胎糞、泄殖腔拭子、腫瘤組織禽腦脊髓炎（AE）發(fā)病雞的腦組織雞病毒性關(guān)節(jié)炎（REO）關(guān)節(jié)及滲出物、腱鞘傳染性法氏囊?。↖BD）法氏囊、腎臟雞傳染性貧血病（CIA）脾臟、胸腺、法氏囊、骨髓禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖?。≧E）全血、脾臟、胸腺、法氏囊、腫瘤組織鴨瘟（DP）全血、鼻咽分泌物、糞便、病變組織鴨病毒性肝炎（DVH）全血、肝臟小結(jié)根據(jù)雞群發(fā)病日齡、發(fā)病時(shí)間、采食情況、死淘情況、產(chǎn)蛋情況、雞舍環(huán)境變化、外界氣候變化等信息，再依據(jù)臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)、大體剖檢病理變化等對雞病做初步診斷，采集相應(yīng)樣品；無法判斷，那么需要多部位采集；保證采集樣本數(shù)量；無菌處理、方法科學(xué)；記錄、保溫、密封；PCR原理PCR反響的根本成分包括5種根本成分：模板DNA、特異性引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸〔dNTPs〕、Mg2+。2024/1/1747以IBV為例組織樣品的處理：肺臟或腎臟等組織樣品中加滅菌的0.85%生理鹽水研磨成5倍～10倍的懸浮液，反復(fù)凍融2次～3次后，以4000g離心10min，取上清液作核酸抽提用。棉拭子的處理：將棉拭子充分捻動(dòng)擰干后除去拭子，0.5mL樣品液經(jīng)4000g離心10min，取上清液作核酸抽提用。細(xì)胞培養(yǎng)物：取1mL細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融2次～3次后，以4000g離心10min后取上清液作核酸抽提用。抽提IBVRNA取200uL病料研磨液中的上清液或尿囊液置于一滅菌的2mL離心管中，同時(shí)設(shè)立陰性尿囊液或陰性細(xì)胞培養(yǎng)液和傳染性支氣管炎病毒M41株陽性病毒液作為陽性對照，再分別參加裂解液1mlTrizol，劇烈混合樣品15s，室溫放置10min。參加200uL三氯甲烷，顛倒離心管混合5次，室溫靜置10min，4℃下10000g離心15min。抽提IBVRNA吸取約500uL上層液至新的無菌離心管中，參加500uL異丙醇/無水乙醇，顛倒混勻，4℃放置10min，4℃下以10000g離心15min。小心棄去全部上清液，參加1mL無RNase水配置的75%乙醇溶液，上下輕緩顛倒2次，4℃下以7500g離心5min。棄去全部上清〔用移液器吸取或者用吸水紙吸干〕，風(fēng)干5～10min，即制得RNA。提取RNA時(shí)需要注意的問題經(jīng)常更換新手套和頭套，皮膚上常帶有的汗水、細(xì)菌、唾液以及空氣中的灰塵都有大量RNase。使用無菌無RNase的塑料制品防止交叉污染。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時(shí)，塑料制品可在0.5MNaOH中浸泡10分鐘，然后用水徹底清洗，高壓滅菌，即可去除RNase。配制溶液應(yīng)使用無RNase的水〔將水參加處理過不含RNase的玻璃瓶中，參加DEPC至終濃度0.01℅v/v,放置過夜,高壓滅菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。〕RT-PCR反響〔40ul體系〕組份加入體積（μL）5×M-MLVBuffer4dNTPMixture3RandomPrimer1M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.4RNaseinhibitor0.4RNA10-24RNase-freewater補(bǔ)至40程序：30℃10min；42℃1h；72℃15min；冷卻至4℃；-20℃保存。設(shè)立以IBVM41株的cDNA為模板的陽性IBV病毒對照和陰性尿囊液或陰性細(xì)胞培養(yǎng)物的cDNA為模板的陰性對照。PCR材料與程序PCR的反響體系組份加入體積（μL）ddH2O13.210×PCRBuffer2.0dNTPMixture1.6Primer.F0.5Primer.R0.5rTaqDNA酶0.2cDNA模板2.0Total2095℃預(yù)變性5min；94℃40s；53℃40s；72℃50共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃終止反響。PCR檢測中的常見問題RNA酶的污染內(nèi)源的RNA酶：進(jìn)行組織裂解時(shí)參加RNA酶抑制劑外部環(huán)境的RNA酶：帶一次性手套和口罩，所有試劑和儀器都必須經(jīng)過消毒處理和RNA酶抑制劑處理EB的問題，替代物Goldview或Gel-redPCR產(chǎn)物的凝膠電泳和回收PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳，100V，45min將電泳結(jié)束的膠板置于紫外拍攝儀中觀察PCR結(jié)果將目的條帶用刀片切下，用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收回收的目的條帶直接送測序公司測序IBV凝膠成像PCR檢測中的常見問題PCR檢測中的常見問題PCR檢測中的常見問題IBV結(jié)果判定IBV測序結(jié)果分析IBVS1基因進(jìn)化分析說明，別離株SD140120-1與流行毒株A2、LX4等均屬于基因型LX4，但不在同一亞分支，而與HB140116B、JS101024等處于同一亞分支，與常規(guī)疫苗株H120等不屬于同一基因型。NDV、AIV檢測結(jié)果的不同分析其他病原疫病名稱核酸類型雞新城疫、禽流感、雞傳染性支氣管炎、雞病毒性關(guān)節(jié)炎、禽呼腸孤、傳染性法氏囊、禽白血病、鴨黃病毒RNA雞傳染性貧血病、雞傳染性喉氣管炎、馬立克氏病、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病、包涵體肝炎、鴨瘟病毒、鴨細(xì)小病毒DNADNA抽提方法180μl樣品+1mlDNAiso，顛倒混勻，靜置5minRT，4℃10000g離心，10min；取上清移至新離心管中，加500μl無水乙醇，反復(fù)顛倒直至出現(xiàn)云霧狀DNA沉淀，4000g離心5min；棄上清，加1ml75%乙醇〔切勿觸及沉淀〕，輕緩上下顛倒洗滌，4℃12000g離心，5min；然后再次洗滌；棄上清，室溫短時(shí)枯燥；加30~60μlTE/ddH2O溶解，-20℃保存。NDV疫苗毒和流行毒株M：1kbMarker1#：NDV基因II型病毒2#：NDV基因VII型病毒N：陰性對照P：NDV別離毒陽性對照PCR區(qū)分IBV的疫苗毒株和流行毒株M:1kbMarker1#:H120株2#：4/91毒株N：陰性對照P：IBV別離毒陽性對照，4/91血清型PCR檢測核酸的優(yōu)點(diǎn)及局限性優(yōu)點(diǎn)必須有一個(gè)龐大的已知序列的數(shù)據(jù)庫。

特異敏感快速、簡便易自動(dòng)化等檢測陰性并不能完全判定陰性PCR的結(jié)果并不總是可靠局限性DNA病毒RNA病毒組織病料或者雞胚尿囊液RTPCR凝膠電泳圖譜觀察分析測序分析小結(jié)步步防止污染；設(shè)置陰陽性對照；IBV、NDV、AIV-H9流行變化趨勢核酸檢測的后續(xù)分析禽原病毒別離實(shí)驗(yàn)室常用的病毒別離方法接種易感動(dòng)物接種SPF雞胚接種敏感細(xì)胞，常用細(xì)胞如DF-1、CEF、Marc-145等。雞胚接種法檢測病原主要?jiǎng)e離毒種：NDV、AIV-H9、AIV-H5、IBV、IBDV、IBHV、ILTV、REOV等。主要接種方式：尿囊腔接種、絨毛尿囊膜接種、卵黃囊接種等。根據(jù)不同毒種對雞胚不同部位的敏感性進(jìn)行接胚。病料接種雞胚的原那么病毒適宜接種部位接種胚齡收獲材料NDV,AIV,IBV尿囊腔9-11尿囊液IBDV,REOV,ILTV,FPV絨毛尿囊膜9-11絨毛尿囊膜及胚體研磨液IBHV，CIAV，ALV卵黃囊5-8胚體研磨液尿囊腔接種絨毛尿囊膜接種卵黃囊接種照胚病料處理接種雞胚培養(yǎng)照胚收胚HA/HIPCR出具檢測結(jié)果用SPF雞胚，至少使用白殼非免胚。孵化時(shí)一般選擇相對濕度為60%，最低溫度36℃，一般37.5℃。每日翻蛋最少3次，大頭朝上，注意雞胚位置孵化3-4天照蛋時(shí)，如果雞胚正?？梢娗逦难芗疤?dòng)，血管分支明顯；去除死胚、無精胚。雞胚的選擇正常雞胚無精蛋死胚裂紋胚IBV病料的處理和接種準(zhǔn)備取病料上清液，加抗生素〔1000IU/mL青霉素和1mg/mL的鏈霉素〕置37°水浴30min或置于4°過夜，然后12000rpm離心取上清液，或者用0.22μm的無菌濾膜過濾除菌。照蛋用鉛筆畫出氣室和胚胎的位置。用碘酊在接種處的蛋殼上消毒并消碘，并在該處打孔。IBV雞胚接種方式接種于5枚9日齡-11日齡SPF雞胚尿囊腔內(nèi)，另取5枚接種PBS液，接種量均為0.2mL/枚。37℃孵育。每天照蛋，24小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚棄去。收集接種后3d-7d的雞胚尿囊液，將所有尿液液混合，用含1000IU/mL青霉素和1mg/mL的鏈霉素的PBS液稀釋5～10倍，繼續(xù)在雞胚內(nèi)傳代。典型的野毒株通常在雞胚中傳至第2代或低3代，可見侏儒胚，傳至第三代，某些雞胚可出現(xiàn)死亡。含毒尿囊液置-60℃以下可長期保存，也可凍干保存4℃保存。IBV雞胚接種方式將別離物經(jīng)雞胚傳至3代或3代以上，收獲接種后7d〔168h〕仍存活的雞胚，取胎兒，用剪刀剪除胎兒體外的附屬物，并用吸水紙吸干胎兒外表的液體。如果接種胎兒重量比對照雞胚胎兒重量少2g以上者，可初步判定為有病毒感染。IBV接胚結(jié)果雞胚呈蜷縮狀，雞胚外層包裹一層絨膜，發(fā)育不全，侏儒胚。絨尿膜接種-人工氣室法取10-11日齡雞胚，先在照蛋燈下檢查雞胚發(fā)育狀況，劃出氣室位置，將絨尿膜發(fā)育區(qū)做一記號。將雞胚橫臥于蛋座上，絨尿膜區(qū)朝上。用碘酒消毒絨尿膜區(qū)及氣室中心部，在氣室中心部錐小孔。然后用錐子在記號處錐一約0.5mm深小孔，使卵殼穿孔，而殼膜不破。用吸耳球吸去氣室部空氣的同時(shí)，上面小孔進(jìn)入空氣而絨尿膜陷下形成一個(gè)人工氣室，天然氣室消失。培養(yǎng)5