分子生物學(xué)平臺(tái)上的食品微生物快速檢測及鑒定技術(shù)課件

分子生物學(xué)平臺(tái)上的食品微生物快速檢測及鑒定技術(shù)在分子生物學(xué)技術(shù)上引領(lǐng)前行1LifeTechnologiesProfile

美國生命技術(shù)公司營業(yè)收入~$3.2B產(chǎn)品種類~50,000國家160員工數(shù)量9,600客戶數(shù)量~75,000專利許可~3,600Note:LTMrevenueasofSeptember30,2009;doesnotincludeMassSpecJVrevenue2臨床分子診斷基因治療藥物再生醫(yī)學(xué)工業(yè)生物制藥法醫(yī)食品安全動(dòng)物健康科研PCR技術(shù)測序技術(shù)細(xì)胞(分離,操作，分析)“ToolsProvider”提供工具“SolutionsProvider”提供解決方案AppliedBiosystems–分子生物學(xué)技術(shù)的領(lǐng)導(dǎo)者超過25年的分子生物學(xué)產(chǎn)品開發(fā)歷程1982年,全球第一臺(tái)蛋白質(zhì)測序儀；1986年，全球第一臺(tái)核酸測序儀1986年，全球第一個(gè)實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)和TaqMan?技術(shù)全球>30,000個(gè)實(shí)驗(yàn)室的>220,000儀器正在被使用3LifeTechnology食品微生物系統(tǒng)解決方案樣品前處理Dynabead?磁珠富集MagMAX?Express核酸自動(dòng)提取快速檢測RapidFinder?常規(guī)qPCR檢測超高通量的篩查OpenArray?芯片鑒定與分型MicroSEQ?ID基因分析靈活的組合方案，滿足不同層次的應(yīng)用需求4病原微生物樣品制備

PrepSEQ?

快速離心核酸提取試劑盒AB專利的離心柱材料較化學(xué)法，更加有效去除PCR抑制劑步驟少、操作簡單可處理多達(dá)750uL的樣品無需額外的設(shè)備適合少量樣品采用PrepSEQ?快速離心試劑盒，結(jié)果明顯優(yōu)于普通直接裂解；尤其對(duì)于存在PCR抑制劑的樣品，普通裂解法可能無法檢出，而PrepSEQ?快速離心法可以得到一致的結(jié)果樣品：巧克力檢測項(xiàng)目：沙門氏菌樣品：布里奶酪檢測項(xiàng)目：李斯特菌*標(biāo)注的是因PCR抑制劑的存在導(dǎo)致樣品中待測菌無法檢出5病原微生物樣品制備

SamplePCRcompatibleNAsolutionLysisMagneticParticles+BindingSolutionWash2XMagneticSeparationMagneticSeparationElutionMME-96核酸提取儀自動(dòng)化高通量自動(dòng)化的理想選擇PrepSEQ?

核酸提取試劑盒提高核酸回收率有效去除抑制劑食品，環(huán)境及臨床樣品+自動(dòng)化的核酸提取流程，一次最多處理96個(gè)樣品6食品致病菌檢測解決方案樣品制備軟件

RapidFinder?Express軟件PrepSEQ?RapidSpin樣品制備系統(tǒng)檢測試劑MicroSEQ?

食品致病菌檢測試劑盒儀器7500快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器PrepSEQ?NAExtraction

樣品制備系統(tǒng)7食品及環(huán)境病原微生物檢測致病菌系列沙門氏菌（AOACcertificated）單增李斯特菌（AOACcertificated）李斯特菌屬（AOACcertificated）大腸桿菌O157:H7（AOACcertificated）阪崎腸桿菌空腸彎曲桿菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌彎曲桿菌多重檢測：空腸/大腸/紅嘴鷗金黃色葡萄球菌創(chuàng)傷、霍亂和副溶血性弧菌的多重檢測定制設(shè)計(jì)環(huán)境和生物安全系列軍團(tuán)菌屬定量檢測試劑盒嗜肺軍團(tuán)菌定量檢測試劑盒土拉弗朗西斯菌檢測試劑盒炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒布魯氏菌屬檢測試劑盒鼠疫耶爾森菌檢測試劑盒8最新O157:H7檢測試劑盒：提升特異性引物、探針設(shè)計(jì)：基于SOLiD?測序技術(shù)分析結(jié)果新的設(shè)計(jì)，針對(duì)O157:H7特有的序列，避免O55:H7被測出-雙重目標(biāo)基因設(shè)計(jì)，提高特異性-將O55全基因組測序，并與O157相比較ORFs(bothstrands)GCcontentper1000bpO157:H7(EDL933)referencesequenceO157:H7SOLiD?coverageO55:H7SOLiD?coverageO157:H7uniquesequences9TaqMan實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證：包括低濃度的O157:H7/HM不同菌株包括對(duì)非O157:H7的大腸桿菌菌株的檢測不含O157的真實(shí)牛肉樣品最新O157:H7檢測試劑盒：提升特異性10O157:H7檢測試劑盒：8小時(shí)內(nèi)獲得結(jié)果6小時(shí)BHI增菌60分鐘DNA提取40分鐘PCR25g牛肉手工操作時(shí)間<1小時(shí)10分鐘10分鐘整個(gè)流程~8小時(shí)MicroSEQ?

大腸桿菌

O157:H7工作流程10分鐘樣品制備設(shè)置10分鐘10分鐘PCR設(shè)置市場上最快的檢測方法已經(jīng)獲得AOAC及AFNOR的認(rèn)可11MicroSEQ?

沙門氏菌檢測操作流程–

快速獲得結(jié)果，最少的手工操作時(shí)間<18小時(shí)獲得結(jié)果過夜增菌提取反應(yīng)設(shè)置

運(yùn)行及分析1216SrDNA雙氮養(yǎng)弧菌與創(chuàng)傷弧菌，解蛋白弧菌與副溶血性弧菌，最小弧菌與霍亂弧菌的親緣關(guān)系很近基于公共數(shù)據(jù)庫，AB自有數(shù)據(jù)庫，特定基因測序分析，篩選出針對(duì)三個(gè)目標(biāo)菌種的8個(gè)不同基因的19個(gè)AssayMicroSEQ微生物鑒定系統(tǒng)快速同時(shí)檢測創(chuàng)傷弧菌，副溶血性弧菌，霍亂弧菌13弧菌多重PCR設(shè)計(jì)考慮到多重檢測在一起的相互影響，三個(gè)不同的種分別設(shè)計(jì)了1-2套不同的Assay14優(yōu)化配方，最終實(shí)現(xiàn)弧菌的多重檢測通過不同的熒光標(biāo)記，將副弧、霍亂、創(chuàng)傷這三個(gè)不同種的弧菌區(qū)分開來15開放的系統(tǒng):滿足不同的食品檢測需求致病菌檢測試劑盒沙門氏菌，單增李斯特菌大腸桿菌O157:H7空腸彎曲桿菌，金葡菌綠膿桿菌，副弧/霍亂/創(chuàng)傷軍團(tuán)菌,坂崎桿菌個(gè)性化訂制引物、探針合成服務(wù)轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒玉米轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒大豆轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒動(dòng)物健康檢測試劑盒禽流感，新城疫藍(lán)耳病，豬胎毛滴蟲豬肺炎支原體，豬瘟藍(lán)舌病，副結(jié)核牛病毒性腹瀉病毒牛呼吸道合胞體病毒

客戶實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)合成實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)人類傳染病檢測試劑盒甲型H1N1檢測甲型流感通用型流感亞型H5/H7/N1炭疽芽孢桿菌/布魯氏菌鼠疫耶爾森土拉弗朗西斯菌肉類ID鑒定試劑盒豬肉ID鑒定牛肉ID鑒定雞肉ID鑒定1617OpenArray?定量PCR微流體芯片

HydrophilicHydrophobicDataPointsperdaywithOpenArray基因分型基因表達(dá)70,00032,000OpenArrayPlateLayout子陣48(12x4)通孔:33nl64通孔/子陣(8x8)SPATIALMULTIPLEXING…3072個(gè)通孔：相當(dāng)于32x96孔板或者8x384微孔板18TaqManOpenArray玻片:格式SNP位點(diǎn)數(shù)163212864192256樣本數(shù)1449648241612XXXXXXOpenArray?SNP芯片：格式19為什么使用OpenArray做病原體檢測一次實(shí)驗(yàn)，檢測并定量多種病原體生物

一次檢測多樣本

快速出結(jié)果

靈敏度和準(zhǔn)確性優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)法和免疫法LifeTech可以幫助用戶設(shè)計(jì)所需的芯片20應(yīng)用案例：人類病原體檢測來自RobertSlinger小組在加拿大安大略省兒童醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)結(jié)果從臨床樣品(咽喉拭子棒）快速檢測多種呼吸道病毒或病菌.

驗(yàn)證在OpenArray平臺(tái)上檢測納升級(jí)別的qPCR反應(yīng)的適用性“WewantedtoseeifwecoulduseqPCRtofigureoutthecauseofinfections,andthoughttheOpenArrayplatformhadthemostpotentialbecausewecoulddothousandsofreactionsatonce,”–RobertSlinger,CHEO21Viral

InfluenzaA-panInfluenzaAH3,H1&H5InfluenzaAH1Swine2009strainInfluenzaAN1oseltamivir-resistancemutationInfluenzaBRespiratorysyncytialvirusAandBParainfluenzavirus1-4RhinovirusEnterovirusCoronavirusOC43,NL63,HKU1,229EHumanmetapneumovirusBocavirusAdenovirus一張芯片整合多種呼吸道病原體檢測BacterialMycoplasmapneumoniaeChlamydophilapneumoniaeLegionellapneumophilaMycobacteriumtuberculosisStreptococcuspneumoniaeStreptococcuspyogenesStaphylococcusaureusMethicillin-resistantStaphylococcusaureusStreptococcusdysgalactiaesubsp.Equisimilis(GroupCandGstreptococci)Streptococcusagalactiae(GroupBstreptococcus)HaemophilusinfluenzaeMoraxellacararrhalisBordetellapertussisBordetellaparapertussisOnesample每個(gè)樣本檢測22種呼吸道病毒和16種呼吸道細(xì)菌

每張芯片檢測12個(gè)樣本

每個(gè)檢測3重復(fù)

每個(gè)病毒檢測3個(gè)target

每個(gè)和樣品8個(gè)空白對(duì)照內(nèi)參人工合成對(duì)照qPCRAssays22MicroSEQ?微生物鑒定系統(tǒng)23微生物鑒定分型發(fā)展的三個(gè)階段

第一階段：依據(jù)表型鑒定分型培養(yǎng)、格蘭氏染色、生理生化、形態(tài)學(xué)等黃金時(shí)代：上世紀(jì)80年代-本世紀(jì)初

第二階段：片段長度多態(tài)性分析

限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA(RAPD)、脈沖場凝膠電泳(PFGE)、細(xì)菌的核糖體基因分型(Ribotyping)、多位點(diǎn)序列分析(MLST)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)、重復(fù)序列擴(kuò)增(rep-PCR)黃金時(shí)代：本世紀(jì)初-至今

第三階段：基因序列分析（分子生物學(xué)的方法）采用測序技術(shù)，確定目標(biāo)基因的每個(gè)堿基黃金時(shí)代：現(xiàn)在-未來5-10年/下一代單分子測序技術(shù)產(chǎn)生24

基于16S核糖體基因測序的鑒定方法

伯杰氏手冊(cè)推薦細(xì)菌命名學(xué)的新標(biāo)準(zhǔn)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》采用16SrDNA測序提供更高的分類學(xué)信息

快速準(zhǔn)確提供鑒定結(jié)果客觀性，重現(xiàn)性好方便不同團(tuán)體、實(shí)驗(yàn)室間信息共享和交流正在成為微生物鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)25MicroSEQTM微生物鑒定系統(tǒng)不需要事前掌握微生物的信息

微小的可見的單菌落即可無需革蘭氏染色無需生化試驗(yàn)無需鑒定的經(jīng)驗(yàn)Easy5-stepWorkflow26結(jié)果–數(shù)據(jù)比對(duì)結(jié)果種最高匹配同源性–遺傳進(jìn)化樹差異27

MicroSEQ?ID經(jīng)過驗(yàn)證的強(qiáng)大數(shù)據(jù)庫全部經(jīng)過驗(yàn)證16S

500: 2020entries16S全基因: 1261entriesD2(真菌): 1113entries每隔一年半定期更新新增加的菌最新的命名原則包括諸多環(huán)境分離菌的信息使用者可以登錄公司網(wǎng)站提供建議最大，最全面且經(jīng)過驗(yàn)證的細(xì)菌和真菌數(shù)據(jù)庫28MicroSEQID鑒定技術(shù)的特點(diǎn)

MicroSEQID的方法準(zhǔn)確重現(xiàn)性好穩(wěn)定簡單將不能或難以鑒定的微生物種類從20％下降到2％！29微生物鑒定及菌株分子分型

滿足不同層次的應(yīng)用需求MicroSEQ?微生物鑒定系統(tǒng)基于16SrRNA序列測定實(shí)現(xiàn)細(xì)菌在種水平的鑒定

基于核糖體大亞基(LSU)序列測定實(shí)現(xiàn)真菌在種水平的鑒定菌株分型的分子平臺(tái)測序檢測MLST片段分析AFLPMLVA微生物耐藥機(jī)理的研究SNaPshotMultiplex SSCP30遺傳分析儀在MLVA研究中的應(yīng)用多重PCR選擇正確的擴(kuò)增引物是取得成功的關(guān)鍵16個(gè)甚至更多的STR位點(diǎn)同時(shí)被擴(kuò)增7repeats8repeatsSTR位點(diǎn)由特定引物延伸的旁側(cè)序列具有保守性不同菌株的串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)存在差異AMELD3TH01TPOXPentaDPentaEFGAD21D18CSFD16D7D13D5VWAD8由遺傳分析儀電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物/片段結(jié)合不同的熒光染料標(biāo)記和遷移率的修飾技術(shù)，實(shí)現(xiàn)多重分析31STECO157/SalmonellaTyphimuriumProtocolMLVA是食源性微生物分型國際組織Pulsenet推薦的食品微生物分型方法，中國CDC及各省級(jí)CDC均設(shè)立相關(guān)機(jī)構(gòu)參與其中.32大腸桿菌7個(gè)位點(diǎn)的MLVA，實(shí)現(xiàn)對(duì)O157:H7的分型Lindstedt,etal.(2003)Ann.Clin.Microbiol.Antimicr.,2,12.SevenlocusMLVAschemeinasingledyechannelIdentified47distinctMLVApatternsamong73O157:H7strainsSequencealignmentoftheVhec4VNTRlocifromisolatesG5300andIHE5344.TheresultsfromthesequencingshowthattheelectrophoreticmobilityshiftbetweenisolatesIHE5344(upperstrand)andG5300(lowerstrand)iscausedbydifferentnumbersofAAATAGrepeatunitsaloneEscherichiacoliO1