基因工程實驗報告

基因工程實驗報告、

小麥GAPDH截短體的重組與表達(dá)摘要：本實驗通過基因工程（geneticengineering）手段對小麥總RNA進(jìn)行提取、PCR擴(kuò)增及與質(zhì)粒載體的重組構(gòu)建的操作，并將重組質(zhì)粒以氯化鈣法導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，并在蛋白水平進(jìn)行Western檢測。通過本對實驗的實踐，我們對基因工程技術(shù)將會有一個比較全面的認(rèn)識和了解。關(guān)鍵字：小麥基因；載體；感受態(tài)前言基因工程（genetic

engineering）又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)。為在分子水平上對基因進(jìn)行操作的復(fù)雜技術(shù)，是將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的操作。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)——DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長、繁殖的受體細(xì)胞中，以讓外源物質(zhì)在其中“安家落戶”，進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新物種的一種嶄新技術(shù)。它克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和障礙。實驗過程操作步驟培養(yǎng)細(xì)菌將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種于LB平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，然后從平板上挑取單菌落，接種于5mL液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h。提取步驟柱平衡步驟：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12,000rpm（~13,400×g）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（請使用當(dāng)天處理過的柱子）取1-5mL過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺式離心，12,000rpm（~13,400×g）離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。向留有菌體沉淀的離心管中加入250μL溶液P1（請先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀。向離心管中加入250μL溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。向離心管中加入350μL溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000rpm（~13,400×g）離心10min，此時在離心管底部形成沉淀。將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意盡量不要吸出沉淀。12,000rpm（~13,400×g）離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW（請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。重復(fù)操作步驟7。將吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm（~13,400×g）離心2min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。將吸附柱CP3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50-100μL洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12,000rpm（~13,400×g）離心2min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。瓊脂糖凝膠電泳法檢測提取的質(zhì)粒DNA表達(dá)載體和目的片段的酶切試劑BamHⅠSalⅠBamHⅠbuffer質(zhì)粒提取試劑盒操作步驟在LB液體培養(yǎng)基中接入帶pGEX4T-1質(zhì)粒的菌種，在37℃下200rpm搖菌過夜。參見實驗8的方法提取質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA和目的片段的酶切管號pGEX4T-132μLPCR產(chǎn)物32μLddH2O10μL10μLBamHⅠBuffer（10×）5μL5μLBamHⅠ1μL1μLSalⅠ2μL2μL載體和外源DNA的連接反應(yīng)試劑目標(biāo)DNA片段（PCR擴(kuò)增產(chǎn)物）載體（pGEX4T-1酶切回收產(chǎn)物）10×ligation緩沖液T4DNA連接酶ddH2O操作步驟取一個200μL的EP管依次加入下列試劑：2×buffer：5μLpGEX4T-1酶切回收產(chǎn)物：1μLPfu擴(kuò)增并酶切回收的片段：3μLT4連接酶：1μL離心30Sec，使反應(yīng)體系充分混合，16～22℃連接3～4h。感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化實驗材料大腸桿菌Top10或BL21（DE3）PlysS試劑①LB培養(yǎng)基（液體和固體培養(yǎng)基配置方法參見附錄2）②氨芐青霉素操作步驟感受態(tài)的制備從LB平板上挑取單克隆于5mlLB培養(yǎng)基中，37℃200rpm搖菌12～16h。將活化過的菌按1～5％的體積比接種到新的LB液體培養(yǎng)基中，37℃200rpm搖菌約2h，OD600約為0.4。取1.5ml搖好的菌液于一個1.5ml的EP管中，4℃4000rpm離心3min，棄上清。加250μL0.1M的CaCl2（滅菌預(yù)冷）溫和懸浮菌體，4℃6000rpm離心1min棄上清。加200μL0.1M的CaCl2（滅菌預(yù)冷）溫和懸浮菌體，即為感受態(tài)細(xì)胞。置于4℃存放。12h內(nèi)使用效果最佳。注意：無菌操作和保持低溫。培養(yǎng)物處于對數(shù)生長期是制備感受態(tài)細(xì)胞的關(guān)鍵。如果要求高轉(zhuǎn)化效率，不建議使用簡單深凍保存的感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化將盛有感受態(tài)細(xì)胞的EP管放置于冰上10min，加入10μL連接產(chǎn)物（若加質(zhì)粒，則只需加1μL），溫和混勻，冰浴20~30min。42℃熱激90S。冰浴5~10min。加入800μLLB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)45～60min。4000rpm離心2min，棄去800μL上清液，剩余混勻用來涂板。取含有50～100g/mlAmp的LB平板培養(yǎng)基（若進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，在培養(yǎng)皿上先涂布4μL200mg/ml的IPTG和40μL20mm/ml的X-Gal），涂板。37℃倒置培養(yǎng)16~20h?？寺〉暮Y選和快速鑒定9.1試劑TaqDNA聚合酶10×buffer（含MgCl2）dNTPLoadingbuffer操作步驟9.2.1提取質(zhì)粒測定取一培養(yǎng)皿在底部標(biāo)記，待轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌落長直徑到2mm時，用接種針（或用滅菌的牙簽、小槍頭）挑取單克隆菌落，劃在培養(yǎng)皿上作好標(biāo)記的方格內(nèi)；同時在對應(yīng)編號的培養(yǎng)管中接種，培養(yǎng)管中含5mlLB液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)皿37℃培養(yǎng)6h后4℃保存。培養(yǎng)管37℃振蕩培養(yǎng)12h左右。用培養(yǎng)管中的菌液提取質(zhì)粒。酶切電泳檢查質(zhì)?；蜻M(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定。菌落PCR鑒定法直接用接種針或牙簽挑取少許菌體加入20的PCR反應(yīng)體系中。試劑體積（20μL）2×PCRMix10μL引物GAPDH1-11μL引物GAPDH1-21μL模板(單菌落)1個ddH2O8μLPCR程序：94℃3min94℃30s58℃30s30cycles72℃45s72℃10min電泳檢測PCR產(chǎn)物，挑選對應(yīng)的陽性克隆菌落。目的基因誘導(dǎo)表達(dá)分別挑取對照菌和重組菌菌落，接入5ml含Amp（100g/ml）的LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。分別取500μL過夜培養(yǎng)物接入5ml含Amp（100g/ml）的LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)2h左右，至對數(shù)中期（OD600=0.5~0.6）。向誘導(dǎo)管中加入IPTG使其濃度達(dá)到0.6mmol/L，25℃振蕩培養(yǎng)過夜，收菌取樣進(jìn)行蛋白電泳檢測。WesternBlotting試劑細(xì)菌培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)LB液體培養(yǎng)基IPTGAmp電泳試劑30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺29.0g，甲叉雙丙烯酰胺1.0g，加水至100ml，棕色瓶4℃保存。1.5mol/LTris-HCl分離膠緩沖液pH8.8（4×）：取18.15gTris，用1mol/LHCl調(diào)pH至8.8，加水至100ml，4℃保存。0.5mol/LTris-HCl濃縮膠緩沖液，pH6.8（8×）：取11.96gTris，用1mol/LHCl調(diào)至pH6.8，加水至100ml，4℃保存。電極緩沖液（pH8.3）：取14.49g甘氨酸，3.02gTris，加100ml10%SDS，加水至1升，4℃保存。10%SDS：取10gSDS加水至100ml，完全溶解后室溫保存。10%過硫酸銨溶液（AP）：臨用前現(xiàn)配。染色液（0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250、50%甲醇、7%乙酸）：考馬斯亮藍(lán)R-2502.5g、甲醇（可用無水乙醇代替）500ml、70ml冰乙酸，溶解后補(bǔ)足水至總體積1000ml。脫色液（30%甲醇、7%乙酸）：甲醇（可用無水乙醇代替）300ml，冰乙酸70ml，補(bǔ)足水至1000ml。樣品緩沖液（2×）：H2O2.4ml，濃縮膠緩沖液1.0ml、甘油0.8ml、10%SDS3.2ml，beta-巰基乙醇0.4ml，0.025%（W/V）溴酚蘭0.2ml。TEMED（四甲基乙二胺）轉(zhuǎn)移和雜交試劑轉(zhuǎn)移緩沖液：3.03gTris、14.4g的Glycine、200ml甲醇、定容到1L。TBS：0.1M的Tris、0.9%的NaCl、pH7.5TTBS：TBS中含0.1%的Tween-20預(yù)染的蛋白marker硝酸纖維素膜脫脂奶粉anti-GST單克隆抗體goat-anti-mouse-IgG-HRP（HRP，horseradishperoxidase，辣根過氧化物酶）3,3'diaminobenzidine（DAB，二氨基聯(lián)苯胺）DAB增強(qiáng)劑電泳準(zhǔn)備步驟將凝膠板水洗滌干凈，然后使其自然風(fēng)干或烘干。梳子臨用前用無水乙醇擦拭，讓其揮發(fā)至干。安裝玻璃板、板條，并將玻璃板固定在灌膠架上。按下表配制適合濃度的分離膠，搖勻后迅速在兩玻璃板間隙中灌注分離膠，小心在膠上覆蓋一層25%的乙醇。H2O4.1029%Acr+1%Bis3.344×分離膠緩沖液(pH8.8)2.5010%SDS0.05TEMED0.0210%過硫酸銨0.02總體積10ml在分離膠聚合的過程（約30min）中，按下表配制5%的濃縮膠，注意TEMED應(yīng)在灌膠前才加入。H2O3.675（ml）29%Acr+1%Bis0.658×濃縮膠緩沖液(pH6.8)0.62510%SDS0.05TEMED0.0510%過硫酸銨0.05總體積5ml分離膠聚合完全后，倒去乙醇，用濾紙吸干膠面上的殘余水。灌注濃縮膠，立即插入干凈的梳子，避免產(chǎn)生氣泡。濃縮膠聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸取電極緩沖液清洗加樣孔數(shù)次，以除去未聚合的丙烯酰胺。將膠板固定于電泳槽上，上下槽各加入電極緩沖液。上樣1）將實驗10獲得的細(xì)胞裂解液按1：1比例加入2×SDS上樣緩沖液混合，100℃沸水浴10min。10000rpm離心1min，置冰上用上清液來點(diǎn)樣電泳。2）用微量進(jìn)樣器加樣，每個點(diǎn)樣孔中加入20μL樣品，同時點(diǎn)蛋白marker。每次應(yīng)洗滌加樣器，最后在空白加樣孔中加入等體積的SDS樣品溶解液。電泳裝好冷凝水系統(tǒng)，打開電源，電壓為100V，電泳直至染料到達(dá)離凝膠底部1cm處。染色從電泳裝置上卸下膠板，小心撬開玻璃板取出凝膠，將膠板放入考馬斯亮藍(lán)R250染色液中染色2h以上。脫色移出凝膠放入脫色液中脫色至本底無色為止。根據(jù)電泳結(jié)果分析誘導(dǎo)菌株有無表達(dá)目的基因。雜交將電泳后的膠板取出，裁取和膠等大的硝酸纖維素膜，按照：海綿-濾紙-膠-硝酸纖維素膜-濾紙-海綿的順序裝入電轉(zhuǎn)印槽中，注意硝酸纖維素膜一定要朝向正極一側(cè)。加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，放在冰水浴中60V電壓（150mA）轉(zhuǎn)印2h。（整個過程應(yīng)帶手套操作）取出硝酸纖維素膜用TBS沖洗一次。室溫下，在脫色搖床上用含10%脫脂奶粉的TBS封閉硝酸纖維素膜1h。倒掉封閉液，用TTBS(含0.1%的吐溫-20)洗膜10min。取1μLanti-GST單克隆抗體（一抗），稀釋在500μL含少量脫脂奶粉（2%的奶粉）的TTBS（含吐溫-20，0.05%）中，將稀釋的一抗均勻點(diǎn)在一干凈的塑料膜（長和寬大約分別是膜的2.5倍和1.5倍）上，要求點(diǎn)一抗的面積同硝酸纖維素膜等大。小心地將硝酸纖維素膜有蛋白一側(cè)鋪在一抗上，注意排除氣泡，同時保持濕度。25℃放置2h（或4℃過夜）。用TBS洗膜2次，用TTBS（含吐溫-20，0.05%）洗1次，每次需持續(xù)約10min。取1μLgoat-anti-mouse-IgG-HRP（二抗），稀釋在500μL含2%的奶粉的TTBS（含吐溫-20，0.05%）中，同樣，將稀釋的二抗均勻點(diǎn)在一干凈的塑料膜上。小心地將硝酸纖維素膜有蛋白一側(cè)鋪在二抗上，注意排除氣泡，同時保持濕度。25℃放置1h。TTBS（含吐溫-20，0.05%）洗膜4~5次，每次5min，將硝酸纖維素膜裝入雜交袋中。在EP管中按1mlBAD增強(qiáng)劑兌50μLDAB配制顯色液，配好的顯色液避光保存，30min內(nèi)有效。在雜交袋中加入顯色液，室溫下顯色2～30min，當(dāng)有清晰的棕褐色條帶出現(xiàn)時，用水沖洗硝酸纖維素膜終止反應(yīng)，觀察并分析結(jié)果，干燥保存。（二）實驗結(jié)果：（1)小麥總RNA提取及電泳分析圖1-1小麥總RNA（2）pGEX4T-1質(zhì)粒的提取的電泳檢測圖1-2pGEX4T-1質(zhì)粒（3）RT-PCR的cDNA的電泳檢測圖1-3RT-PCRcDNA的檢測（4）目的片段的酶切檢測圖1-4目的片段（5）重組質(zhì)粒的電泳分析圖1-5重組質(zhì)粒（6）重組質(zhì)粒的電泳檢測（克隆篩選及快速檢測）圖1-6重組質(zhì)粒的檢測（7）菌落PCR的檢測圖1-7菌落PCR（8）考馬斯亮藍(lán)染色圖1-8考馬斯亮藍(lán)染色（9）Western雜交圖1-9Western雜交（三）實驗結(jié)果分析：如圖1-1，最下端電泳條帶為5sRNA，中間為18SRNA，最上邊為28SRNA。其中泳道的大黑塊為過量的loadingbuffer。電泳結(jié)果出現(xiàn)彌散的現(xiàn)象是RNA被降解引起的，我覺得跟也可能是提的RNA不純或是酶的星活性引起的。如圖1-2，質(zhì)粒提取結(jié)果條帶都比較清晰，總的來說質(zhì)粒的提取較為成功